[发明专利]一种冬虫夏草菌分生孢子插片制备及产孢动态计数方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种冬虫夏草菌分生孢子插片制备及产孢动态计数方法。

背景技术

冬虫夏草[Ophiocordyceps sinensis(Berk.)G.H.Sung，J.M.Sung，Hywel-Jones &Spatafora(＝Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.)]作为中国特有的传统名贵药用菌，在生物分类上归属于真菌界(Kingdom Fungi)、子囊菌门(Ascomycota)、肉座菌目(Hypocreales)、蛇孢虫草科(Ophiocordycipitaceae)、蛇孢虫草属[Ophiocordyceps Petch(＝Cordyceps(Fr.)Link p.p.)]。现代研究表明，冬虫夏草具有免疫调节、祛痰平喘，以及对肝肾损伤的保护等多种药理作用，在抗肿瘤、治疗肾功能衰竭等方面也有较好的应用前景。尽管已经对冬虫夏草做了大量研究工作，但迄今尚不能实现人工栽培的规模生产，还存在明显的技术难题，如冬虫夏草菌生长缓慢，侵染率低，侵染的影响因素不明等问题。这些问题不予以证实和澄清，冬虫夏草的大规模人工培植就难以实现。解决这些问题的前提是全面掌握冬虫夏草菌的生物学性状，因此，冬虫夏草菌生物学研究技术的创新，具有重要的理论和实践意义。

冬虫夏草菌培养研究主要涉及固、液体培养，生长速率，分生孢子产孢能力、继代产孢稳定性和产孢动态等方面。其中，分生孢子的研究与菌剂的制备密切相关。从与冬虫夏草菌相关的白、绿僵菌等其他虫生真菌的侵染机理来看，在适宜的环境条件下，菌株的侵染能力及侵染活性主要包括体表附着能力、体壁穿透能力及抵抗昆虫宿主免疫的能力。而在适宜的基质及培养条件下，冬虫夏草菌可产生疏水性的分子孢子，疏水孢子可与疏水昆虫表面同性相吸，因而基于分生孢子的附着能力考虑，使用分生孢子制作菌剂进行其寄主蝠蛾幼虫感染将具有更高的侵染力。目前，冬虫夏草菌分生孢子的研究存在困难，主要原因是其分生孢子产量少、产孢周期长，在培养观察计数上一直没有很好的解决办法，从而在高产孢菌株的筛选中也没有一个可靠的量化指标。

综上所述，冬虫夏草菌分生孢子的产孢和计数问题已逐渐成为冬虫夏草菌生物学研究的瓶颈。为了最终实现冬虫夏草的大规模人工培植，迫切需要其研究技术的创新。

发明内容

本发明的目的是提供一种计数冬虫夏草菌所产分生孢子的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)将至少一个盖玻片插入接种有冬虫夏草菌液体菌种液的固体培养基中，得到插片平板，所有所述盖玻片的1/6-5/6部分均位于所述固体培养基上方；

2)培养步骤1)得到的插片平板培养至长出菌落，每隔一段时间取至少3个盖玻片计数取平均值，得到冬虫夏草菌在不同时间产生的分生孢子数。

出芽的分生孢子不进行计数。

将冬虫夏草菌株接入冬虫夏草菌液体菌种培养基，在18℃、黑暗条件下进行振荡(转速100rpm)培养14天得到液体菌种液，即为冬虫夏草菌种液。

步骤1)中，所述至少一个盖玻片为6-20个盖玻片，所有所述盖玻片的1/6、1/2或5/6部分均位于所述固体培养基上方；

步骤2)中，所述每隔一段时间取至少3个盖玻片计数为每隔1天-5天取3-5个盖玻片计数。

步骤1)中，所述至少一个盖玻片为6、12或20个盖玻片，所述盖玻片为无菌盖玻片；

步骤2)中，所述每隔一段时间取至少3个盖玻片计数为每隔1天、3天或5天取3个盖玻片计数。

步骤1)中，每1L所述固体培养基按照如下方法制备：(20.0-50.0)克麦麸、(10.0-20.0)克葡萄糖、(2.0-5.0)克蛋白胨、(1.0-3.0)克酵母提取物、200克土豆、(15.0-20.0)克琼脂和水混合，用水补至1L；

每1L所述固体培养基具体按照如下方法制备(按照(中国专利ZL200510137457.8[姚一建、董彩虹、王波、谢雪钦(2005)一种冬虫夏草复合培养方法及其专用培养基。]]：50.0克麦麸、20.0克葡萄糖、5.0克蛋白胨、3.0克酵母提取物、200克土豆、18.0克琼脂和水混合，用水补至1L。

步骤2)中，所述培养温度为15℃-20℃，所述培养为静置暗培养，所述培养时间为15天--25天；

步骤2)中，所述培养温度为15℃、18℃或20℃，所述培养时间为15天、20天或25天，所述计数采用显微镜观察计数。

所述的方法在绘制冬虫夏草菌产分生孢子的动态曲线中的应用也是本发明保护的范围。