[发明专利]一种制备重组大肠杆菌发酵生产丁二酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种制备重组大肠杆菌发酵生产丁二酸的方法，具体涉及一种通过提高菌株胞内NAD⁺的生物合成加快菌株生长速率进而提高厌氧条件下丁二酸生产能力的方法，具体涉及利用分子生物学手段在大肠杆菌中过量表达NAD⁺生物合成相关的一个或者多个基因，并且添加一定浓度的前体物质，最终实现专一性厌氧条件下菌株丁二酸的生产能力。

背景技术

丁二酸为大宗化学品，被广泛应用于医药、农药、染料、香料、油漆、食品和塑料等行业，同时作为优秀的C4平台化合物，可用于合成1,4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯等有机化学品以及聚丁二酸丁二醇酯（PBS）类生物可降解材料，被美国能源部认为是未来12种最有价值的生物炼制产品之一。

利用微生物发酵法转化可再生资源（葡萄糖、木糖等）生产丁二酸，由于原料来源广泛且价格低廉，污染小，环境友好，且在发酵过程中可吸收固定CO₂，能有效缓解温室效应，开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径，近年来成为研究的热点。丁二酸的生产菌株主要包括naerobiospirillum succiniciproducens、Actinobacillus succinogenes、Mannheimia succiniciproducens、重组谷氨酸棒杆菌和重组大肠杆菌。利用野生菌株生产丁二酸，虽然获得了较高的产物浓度，但培养过程培养基成本较高，且甲酸、乙酸等副产物积累较多，阻碍了其工业化进程。

大肠杆菌由于遗传背景清楚、易操作、易调控、培养基要求简单和生长迅速等优点，近年来被广泛用于研究以获得产丁二酸优秀菌株。大肠杆菌作为一种兼性好氧菌，在有氧及厌氧条件下均能生长，但在有氧条件下，菌株生长快速，采用合适的策略细胞最终密度可以提高至细胞干重几百，且胞内碳代谢走三羧酸循环；在厌氧条件下大肠杆菌生长缓慢，且终细胞干重较低，其主要原因可能是厌氧条件下细胞进行混合酸发酵，有大量抑制物产生，另有原因可能是厌氧条件下胞内的电子传递链不起作用，辅酶NAD⁺和ATP供给不足。

利用大肠杆菌生产丁二酸的发酵模式主要包括专一性厌氧发酵及两阶段发酵。国外Vemuri等人利用大肠杆菌AFP111（PYC）两阶段发酵，其厌氧阶段可完成1.1 g·g^-1的丁二酸收率和1.3 g·L^-1·h^-1的丁二酸生产强度（Applied Environmental Microbiology. 2002, 68, 1715～1727）。但如果考虑有氧阶段消耗的糖及花费的时间，收率和生产强度将下降。而专一性厌氧发酵时，由于菌株生长缓慢，且最终菌体密度低，丁二酸终浓度和收率均较低。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种提高大肠杆菌厌氧条件下生长能力的方法，进而提高专一性厌氧发酵过程丁二酸的生产能力。

为实现本发明的技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种制备重组大肠杆菌发酵生产丁二酸的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）在产丁二酸大肠杆菌出发菌株中过量表达pncB，nadD，nadE三种基因中的一个或者多个，得到重组大肠杆菌菌株；

（2）在发酵厌氧培养基中添加烟酸；

（3）利用步骤（1）得到的重组大肠杆菌专一性厌氧发酵生产丁二酸。

其中，本发明所述的发酵厌氧培养基应理解为现有技术中任意大肠杆菌发酵产丁二酸用的常规培养基，特殊地，步骤（2）中所述的添加烟酸的浓度为0.1 mmol/L～1 mmol/L。

本发明的有益效果在于：附图1是NAD⁺的生物合成途径相关的基因；本发明通过过量表达NAD⁺生物合成相关的基因，并且另一方面在发酵厌氧培养基中添加烟酸作为NAD⁺生物合成的前体物质，这样加快了菌株生长速率，将可大幅度提高专一性厌氧发酵生产丁二酸的能力。

附图说明

图1 NAD⁺的生物合成途径。

图2 加入不同浓度的烟酸进行诱导后对菌体生物量及丁二酸产量影响