[发明专利]一种融合蛋白及其融合蛋白表达载体

说明书

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白及融合蛋白表达载体，尤其涉及包含人源性柯萨奇病毒-腺病毒受体胞外区与人IgG1的Fc段的融合蛋白。

背景技术

柯萨奇病毒(Coxsackie enterovirus)，属小RNA病毒科(Picornavirus)，为正链RNA肠道病毒(Enterovirus)。常引起小儿腹泻，能导致无菌性脑膜炎、流行性胸痛、心肌炎、心包炎、手足口病等多种疾病，妊娠期感染可引起非麻痹性脊髓灰质炎性病变，并致胎儿宫内感染和致畸。目前发现，柯萨奇B组病毒(Coxsackie B enterovirus，CVB)常引发小儿病毒性心肌炎(Viral Myocarditis，VMC)，是小儿及青少年VMC最常见的病原体，约占各种病毒所致心肌炎的50％。腺病毒(adenovirus，Ad)是一类无包膜双链DNA(double-stranded DNA，dsDNA)病毒，归属于哺乳动物腺病毒属。在自然界中分布较广，是引起上下呼吸道和眼部疾患的常见病原体；同时可引起人体扁桃体、腺样体和其它淋巴组织的隐性持续性感染；此外，腺病毒也是病毒性心肌炎的常见病原体。柯萨奇病、腺病毒的传染性强，尤其是在人口密集的地方，对免疫力低下的患者(如老年人、骨髓移植患者、白血病、艾滋病患者等)，通过飞沫和接触传染，在同一时期可造成区域性流行或暴发流行。柯萨奇病毒分为A和B两类，共30多个血清型；腺病毒可分为A～F 6个亚属，共51个血清型，目前尚无柯萨奇病毒/腺病毒有效疫苗用于预防，针对其特异性药物还有待开发。

因此，从新的角度研制安全、可靠的防治柯萨奇病毒/腺病毒的新型药物十分必要。

近年来，一些学者提出了“病毒受体陷阱疗法”(virus receptor trap therapy)这一概念，所谓“病毒受体陷阱疗法”是指利用外源性的可溶性病毒受体来结合病毒，从而阻断病毒与靶细胞膜上的受体结合及随后的病毒内吞。由于外源性受体分子与细胞膜上的受体分子有相同或非常相似的空间结构，因此，多次、大剂量使用将不存在机体的免疫反应等问题。病毒受体陷阱疗法拓展了病毒性疾病的治疗策略，可成为急性病毒血症期的一个新的有效治疗手段。

研究表明，柯萨奇病毒和腺病毒通过与细胞表面的柯萨奇病毒/腺病毒受体(Coxsackie virus and adenovirus receptor，CAR)特异性地结合完成感染最初的吸附过程，随后通过五邻体蛋白上的精-甘-天门冬氨酸(RGD)序列与细胞表面的整合素αγβ3和αγβ5结合经过胞饮作用使病毒进入细胞从而完成内化过程。因此，CAR是绝大部分柯萨奇病毒和腺病毒进入宿主细胞的关键。

目前，CAR的基础性研究已非常深入。研究表明，CAR是分子量为46KD的跨膜糖蛋白，编码人源CAR(hCAR)的基因已明确定位于染色体21q 11.2上，包含7个外显子，365个氨基酸，分3个结构域。①胞外域：含两个Ig结构域(1.2)，Ad通过纤维顶球的三聚体结构与Ig1结构域结合。②跨膜段：含22个氨基酸，对细胞间相互作用起稳定调节作用。③胞内域：含107个氨基酸，其中前两位Cys残基可能是翻译后脂化修饰位点，此外，胞内域可能还存在Tyr磷酸化位点。

基于这些已有的基础性研究，如果通过基因工程方法，获得CAR的胞外区蛋白(extracellular region of CAR，exCAR)，用于Ad的“受体陷阱疗法”，将能有效的阻止绝大部分型别的腺病毒对人体细胞的感染。

目前，在“病毒性疾病的受体陷阱疗法”这一领域已有一些探索性研究，但仅停留在体外细胞实验和动物模型研究的初步阶段。究其原因，最主要的是活性蛋白的高效表达问题。目前的相关研究一是采用大肠杆菌原核表达系统，该系统能获得较高产量的表达蛋白，但其蛋白表达形式多为包涵体，难以获得大量可溶性活性蛋白；二是采用细胞真核表达系统，如CHO细胞和293T细胞等，此类表达系统能解决表达蛋白的正确折叠和糖基化问题，但其产量很低，成本极高，大量制备极为困难。

所以，“病毒受体陷阱疗法”将来应用人体治疗，实现的关键是能生产制备大量可纯化的具有高生物活性的病毒受体或其亚单位。

发明内容

本发明的目的在于提供一种融合蛋白及融合蛋白的表达载体。

本发明所述的融合蛋白，包含人源性柯萨奇病毒-腺病毒受体胞外区与人IgG1的Fc段。

所述人源性柯萨奇病毒-腺病毒受体胞外区的基因序列其序列如SEQ IDNO：1所示。

所述人IgG1的Fc段的基因序列其序列如SEQ ID NO：2所示。