[发明专利]重组人源脑红蛋白的生物活性检测方法及其用途

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及重组人源脑红蛋白的生物活性检测方法及其用途，特别是重组人源脑红蛋白的清除自由基活性的检测方法及其在制备具有清除自由基功能药物中的用途。

背景技术

脑红蛋白(neuroglobin，Ngb)是2000年新发现的主要表达于神经系统的第三类携氧珠蛋白，功能和性质方面与肌红蛋白类似，与氧有很高的亲和力(P₅₀≈2torr)。对于Ngb蛋白检测，现多集中在蛋白的免疫活性(蛋白印迹检测)和蛋白含量的检测方面，针对Ngb蛋白的生物活性，尤其是清除自由基活性，目前尚无合适的检测方法报道。

申请人在发明专利ZL200510059313.5中公开了重组全长人源脑红蛋白(rhNgb)的制备方法，获得了原核表达的rhNgb蛋白，为rhNgb蛋白在产业上大量生产奠定了基础。然而，产业生产需要有相应的质量标准和质检体系支持，由此，申请人在蛋白水平上对rhNgb的生物活性进行系列深入研究，并有望将研究成果转化为rhNgb蛋白生产的质量标准和质检方法。

目前，国内外有很多关于Ngb抗自由基损伤的研究报道，已经通过真核表达载体技术和转基因等手段(而不是使用Ngb蛋白)，间接证明Ngb具有保护细胞抵抗自由基损伤的功能。如Fordel等(Neurosci Lett，Neuroglobin and cytoglobin overexpression protects human SH-SY5Y neuroblastoma cells against oxidative stress-induced cell death，2006，410(2)：146-51)研究指出，过表达的Ngb能够保护SH-SY5Y细胞抵抗氧化应激诱导的细胞死亡；而Wang等(Stroke，Effects of neuroglobin overexpression on acute brain injury and long-term outcomes after focal cerebral ischemia，2008，39(6)：1869-74)用过表达Ngb的转基因小鼠进行实验，发现Ngb过表达能够减少机体内氧化应激的产生；Nayak等(J Neurochem，Role of neuroglobin in regulating reactive oxygen species in the brain of the anoxia-tolerant turtle Trachemys scripta，2009，110(2)：603-12)研究发现，在体外培养的神经细胞中Ngb能够降低自由基的产生；Li等(Brain Res，Neuroglobin protects PC 12 cells against oxidative stress，2008，1190：159-66)发现，过表达的Ngb能够保护PC12细胞抵抗氧化应激损伤。但是，以上研究只能说明Ngb对自由基引起的细胞损伤具有保护作用，并不能说明Ngb本身对自由基具有清除作用，也无法证明其抗氧化能力，因此文献中所报道的内容并不适合rhNgb生物活性的检测；同时，目前仅有的直接从Ngb蛋白进行的清除自由基研究(Neuro-and cytoglobin are found to show no appreciable superoxide dismutase，catalase，and peroxidase activities.(Gene，Neuroglobin and cytoglobin as potential enzyme or substrate，2007，398(1-2)：103-13))，却并未发现Ngb具有超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性，尚未证明其具有能够清除自由基的能力，导致对于Ngb生物活性的判定出现相互矛盾之处。这可能是由于检测技术灵敏度不足所导致的。因此目前还没有从蛋白水平直接检测Ngb蛋白清除自由基活性的报道。