[发明专利]地鳖虫抗血栓酶Eupolytin1及其基因和应用

说明书

技术领域：

本发明提供一种地鳖虫抗血栓酶Eupolytin1及其基因和应用，属于生物医学技术领域。

背景技术：

随着人们的生活水平不断提高，生活节奏越来越快，繁忙的工作，不合理的饮食结构，不规律的生活作息，抽烟酗酒和缺乏体育运动等众多诱因导致越来越多的人患有各种心血管疾病。世卫组织指出，目前全球每年有1800万人死于心脏病和其他心血管疾病，约占全球死亡人数的三分之一，预计到2020年这个数字将有可能突破2000万。血栓栓塞性疾病严重影响人类的健康，是导致死亡率最高的病因之一。在过去的几十年中，已经开发的抗栓药物主要包括溶栓药、抗凝药和抗血小板药。但是目前市面上的所有抗血栓药物经常伴随着低血压、出血等系统性的副作用，因此，急需开发新型的安全抗血栓药物。

在长期与自然条件做斗争的社会生产实践活动中，我国人民利用各种动物资源预防与治疗各种疾病有着悠久的历史，积累了丰富的药用知识和经验。《本草纲目》和其他地方医药典籍中记载有许多活血化瘀的药方。中药是祖国医药学的重要组成部分，其功效已为几千年的历史和现代临床疗效所肯定。地鳖虫(Eupolyphaga sinensis Walker)，隶属于节肢动物门蜚蠊目鳖蠊科，是一种重要的中药材，具有破血逐瘀、续筋接骨的功效，已被我国各族人民广泛使用一千多年。从传统中药中挖掘预防和治疗血栓疾病的药物先导分子，对于人类的健康是有着非常重要的意义。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种地鳖虫抗血栓酶及其基因和应用。

本发明的技术方案包括地鳖虫抗血栓酶Eupolytin1的制备和氨基酸序列测定，地鳖虫抗血栓酶Eupolytin1基因的克隆，Eupolytin1的体外重组表达和地鳖虫抗血栓酶Eupolytin1的药理实验四部分内容。

地鳖虫抗血栓酶Eupolytin1是我们首次从地鳖虫消化道中肠中分离得到的一种活性蛋白质，分子量约24KDa。抗血栓酶Eupolytin1前体由254个氨基酸组成，其中1-28位氨基酸(斜体部分)为信号肽部分，第29-254位氨基酸为成熟的Eupolytin1蛋白，该前体全序列一级结构为(氨基酸序列为SEQ ID NO：1)：IVGGSDANIEDLPYQLSFEYGGSHMCGASIIS  60

ENWVVTAAHCVDGVSASSARFRAGSSVRGSGGSLHQATQLIANPQYDYYTIDYDVAVARV  120

ATPFSYGSGVQPISLISVEPSAGQTATVSGWGTFFSGGSLPRQLQVVSVPIVSPQQCNND  180

YASYGGITENMICAAEEQGGKDPCQGDSSGPLTVGGQLAGIVSWGAGCAQRGYPGVYSNV  240

ATLRKFITDETGVN-                                               254

地鳖虫抗血栓酶Eupolytin1基因的克隆包括：地鳖虫消化道中肠总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，设计引物，利用PCR方法扩增编码基因。基因测序结果表明地鳖虫抗血栓酶Eupolytin1的编码基因(GenBankaccession Gu187070)由888个核苷酸组成，第85-765位核苷酸编码成熟的Eupolytin1蛋白，该基因的5’端至3’端序列为(核苷酸序列为SEQ ID NO：2)：

atgcttcgtctgctggttctgacctgtcttgttgcctcctgcttcggcgcccgcctacct  60

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attgccaacccccaatacgactactacaccattgattacgatgtcgctgttgctagggta  360