[发明专利]一种对转入玉米的Bar基因进行筛选的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程中的对转基因愈伤组织进行筛选的方法，特别是对转入玉米的Bar基因愈伤组织进行筛选的方法。

背景技术

筛选含有目的基因的转化体是基因工程的重要环节。其基本方法是将筛选标记基因和目的基因构建到同一载体上，通过对未转化体的选择性抑制，达到筛选转化体的目的，选择标记基因主要是抗生素或抗除草剂基因。以往基因转化中一般采用抗生素作为筛选标记系统。由于转化细胞对抗生素的解毒作用导致的交叉保护，高频率的未转化植株和嵌合体也通过了抗生素筛选。目前，抗除草剂基因已越来越多地应用于植物遗传转化，它克服了抗生素筛选的局限性，细胞产生的假转化体很少，已成功地用于小麦、水稻、玉米、大麦、高粱、燕麦、黑麦、油菜等作物的转化。

抗广谱除草剂草丁膦(glufosinate)的Bar基因(bialaphos resistance gene)是常用的选择标记基因之一，已被克隆与测序，通过生物技术已将该基因导入20多种作物。

在培养基中用草丁膦筛选转入玉米愈伤组织的Bar基因较为困难。草丁膦属有机磷类除草剂，是非选择性、广谱除草剂Liberty(商业用名还有Basta、Ignite、Challange及Finale等)的活性成份。在一些文献中常被称为Phosphinothricin(PPT，膦丝菌)。L-草丁膦强烈抑制细菌和植物的氨基酸生物合成酶-谷氨酰胺合成酶(Glutam ine synthetase GS)。双丙氨膦(bialaphos)是由链霉素属(S treptomyces)的一些小种产生的草丁膦的三肽前体，它由来自于这些小种中的2个L-丙氨酸残基并与PPT相连组成。完整的三肽不具离体抑制活性。通过植物体中的肽酶除去2个L-丙氨酸残基后，在细胞内释放出的PPT才有活性。但在植物组织培养中，植物细胞缺乏光照和光和作用，草丁膦在无法起到筛选的作用，发现用草甘膦筛选Bar基因效果较好。

Bar基因的抗性机理：(1)产生过量的靶标酶或靶标蛋白质，降低除草剂毒性。有多种形式的GS同工酶，只有细胞质形式GS和PPT抗性有关。(2)产生能修饰除草剂的酶或酶系统，在除草剂发生作用前将其降解或解毒。Glufosinate(或bialaphos)抗性Bar基因，克隆来自土壤吸水链霉菌(S treptomyces hygroscopicus)。它编码膦丝菌素乙酰转移酶(phosphinthricin acetyltransferase PAT)，PAT使PPT的自由氨基乙酰化从而对PPT解毒，使之不能抑制GS的活性。含有该基因的植物具有对Liberty的抗性。

草甘膦作为一种非选择性除草剂，其作用机理主要是竞争性抑制莽草酸途径中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性。该合成酶是真菌、细菌、藻类和高等植物体内芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)生物合成过程中一个关键性的酶。目前，关于用草甘膦筛选Bar基因的方法尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种对转入玉米的Bar基因进行筛选的方法，可以减少假阳性植株的产生，大大提高了筛选效率，避免了大量的重复劳动，对于玉米基因工程和遗传育种实践具有重要意义。

本发明提供的一种对转入玉米的Bar基因进行筛选的方法包括以下步骤：

经过预培养的外植体接种于携带双元质粒p3300的农杆菌菌株EHA105的菌液中浸染，浸染后的外植体经共培养、含有草甘膦的筛选培养基I与筛选培养基II中筛选，再依次经过再生培养基I与再生培养基II中再生培养诱导形成胚状体和苗体，选择苗体盆栽得到的抗性植株，再用PCR检测和经凝胶电泳法证实筛选获得阳性植株为转基因植株。

所述的双元质粒p3300是在其上的T-DNA区含有八氢番茄红素合成酶基因(PSY)和PPT乙酰转移酶基因(Bar)。

所述的农杆菌菌液是将携带双元质粒p3300的农杆菌菌株EHA105的单菌落接种于含100mg/l卡那霉素的YEP培养液中，28℃、160rpm振荡培养12h，当细菌达到对数生长期时，4℃、4000rpm离心收集菌体，重悬于感染培养基，菌液浓度约为OD₆₀₀＝0.6-0.8.

所述的外植体的预培养是取自交系的8-13d的幼雌穗，表面用75％的酒精消毒，再用0.1％的氯化汞浸泡8分钟，无菌水洗3次后挑取幼胚接种在诱导培养基上，24℃条件下暗培养7～10d后，拔去生长出的微芽，转入新的诱导培养基上，继代2～3周产生I型愈伤组织，继代1～2次后产生II型愈伤组织，每14d继代1次；取生长旺盛的II型愈伤组织作为农杆菌转化的受体材料。