[发明专利]快速检测四种硝基呋喃类药物的免疫纳米金试纸条

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速检测四种硝基呋喃类药物的免疫纳米金试纸条，总体属于农业领域（畜牧与水产业），具体属于动物源性产品安全检测/兽药残留检测领域。

背景技术

呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃它酮均属于化学合成的硝基呋喃类广谱抗菌药物，但由于它们的原形药和代谢物具有致癌性和致突变作用，已被中国农业部列为禁止用于食品动物的药物。但这些药物往往被添加在动物饲料中违法使用，因此而造成的兽药残留会严重影响动物性产品安全，威胁消费者身体健康。因此，检测饲料中非法添加的此类药物可从源头保护动物性产品的质量安全。

目前，有些研究者采用免疫学方法对此类药物进行检测。如专利200510111229，其声明将呋喃唑酮直接与载体蛋白连接作为免疫原，获得抗体制备免疫纳米金试纸条可检测饲料中的呋喃唑酮；再如专利200610041481，其声明制备了呋喃西林的单克隆抗体，建立的ELISA方法可检测呋喃西林。但其没有给出免疫原的制备方法，按免疫学原理推断，申请者也应是将呋喃西林直接与载体蛋白连接。这些方法技术均只能检测一种硝基呋喃类药物，而不能同时检测其他几种硝基呋喃类药物。因此，研究制备可同时对饲料中这四种硝基呋喃类药物进行快速检测的方法技术非常重要。目前已有的方法技术不能同时检测这四种硝基呋喃类药物，是因为它们的免疫原在合成时只针对一种药物，存在很大不足。硝基呋喃类药物的分子结构母核是5-硝基呋喃环，上述四种药物都含有这一结构。而一种药物合成中间体5-硝基糠醛也含有这一结构，针对5-硝基糠醛的抗体就能同时识别这四种药物。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种能快速检测四种硝基呋喃类药物的免疫纳米金试纸条。

本发明采取的技术方案如下：

一种快速检测四种硝基呋喃类药物的免疫纳米金试纸条，其制备方法如下：

（1）合成通用半抗原：称取5-硝基糠醛50-80mg溶于3-5mL乙醇中得A液；称取硫酸联氨70-100mg溶于5-10mL蒸馏水中得B液；室温下将A液逐滴滴加到B液中，搅拌反应30-60分钟，得黄色沉淀；用饱和碳酸钠溶液中和上述反应液至pH6.0-8.0后，将此混和液抽滤至干；所剩固体用10-20mL蒸馏水洗涤，再抽滤至干，自然干燥即得通用半抗原；

（2）合成免疫原：称取所述半抗原10-20mg 溶于5-10mL甲醇中，搅拌条件下逐滴滴加到含牛血清白蛋白30-50mg的浓度为0.01mol/L、pH7.0-7.4磷酸缓冲液5-10mL中；然后逐滴加入浓度为25%的戊二醛溶液60-100μL，20-25℃反应4小时即得免疫原溶液，然后在4℃生理盐水中透析72小时，透析液冷冻保存；

（3）合成捕获抗原：称取所述半抗原10-20mg 溶于5-10mL甲醇中，冷却至4 ℃；然后，在4 ℃条件下用盐酸调节pH为1.0-3.0，再逐滴加入0.2-0.5mol/L的亚硝酸钠溶液1-4mL，搅拌反应至淀粉碘化钾试纸检验呈灰蓝色为止；然后用氢氧化钠溶液调 pH至7.5-9.0；将所得溶液逐滴加入到含卵清蛋白10-20mg的浓度为0.01mol/L、pH7.0-7.4的磷酸缓冲液5-10mL中，4℃搅拌反应8-16h即得捕获抗原溶液，然后在生理盐水中透析72小时，透析液冷冻保存；

（4）制备多克隆IgG抗体：将所述免疫原用生理盐水稀释为1mg/mL，加与稀释后免疫原溶液等量的氟氏完全佐剂制成乳化剂，在实验动物家兔的背部皮内多点注射进行首免，免疫剂量0.2-0.8mg/只；3-4周后，取1mg/mL的免疫原溶液加与免疫原溶液等量的氟氏不完全佐剂乳化后在实验动物家兔背部皮下多点注射进行加强免疫，免疫剂量0.2-0.8mg/只，每4周加强免疫一次，共免疫6-8次；最后一次免疫，为免疫原直接耳缘静脉注射，免疫剂量0.2-0.8mg/只；然后，取兔全血分离血清，采用饱和硫酸铵法对血清中的IgG进行粗提；粗提液在浓度0.01mol/L、pH7.0-7.4的磷酸缓冲液中透析2-3天以脱盐；透析液再用DEAE-52层析柱进行纯化；纯化后的IgG溶液再在浓度0.01mol/L，pH7.0-7.4的磷酸缓冲液中透析2-3天以脱盐，即得多克隆IgG抗体溶液，最后冷冻保存；

（5）制备纳米金溶液：取0.01%-0.05%的氯金酸溶液100mL恒温搅拌加热至沸腾，在持续搅拌的情况下加入1%-4%的柠檬酸三钠溶液1-4mL，继续搅拌加热20-30分钟，至溶液呈透亮红色，室温冷却，用去离子水恢复至100mL，即得纳米金溶液，4℃保存备用；