[发明专利]三日型猴疟动物模型及其建立方法

说明书

技术领域

本发明涉及在中国境内野生猴体内发现的一株猪尾猴疟原虫中国株H(Plasmoiuminui-China Huang)即三日型猴疟原虫，并可通过人工饲养的按蚊传染或直接血液传染给健康猴，建立起非人灵长类疟原虫动物模型，尤其是一种三日型猴疟动物模型及其建立方法。

背景技术

疟疾仍然是目前世界上引起人类发病率和死亡率最高的疾病之一，据世界卫生组织的报道每年全球约有250-350万人死于疟疾的感染。我国每年大概发现有74万多的疟疾病人，并出现有恶性疟病人对传统抗疟药物产生抗性的病人，北方五省(苏、鲁、豫、皖、鄂)的疟疾发病率出现回升并有局部的爆发点，因此，国内外均在加紧对疟疾的研究。

在对疟疾的研究过程中，非人灵长类动物是研究人类疟原虫十分重要的动物模型，而能将人类疟原虫感染给大猩猩及南美洲的夜猴(Aotus monkey)的动物模型其数量稀少价格昂贵且不易获得。因此，在过去100多年里各国科学家通过努力发现在世界范围内广泛分布的猕猴中寻找出多种猴疟原虫，通过生物学的观察分类发现不同种类的猴疟原虫与人类不同种类的疟原虫不论是红细胞内各期疟原虫形态和裂变周期，还是在蚊体内发育均具有着十分相似的生物学特征，为此各国均建立起了不同种类的猴疟动物模型。尽管如此，从猴分离的疟原虫按人疟原虫的分类法分为恶性疟型、间日型和三日型等，依据是红细胞内期裂体增殖循环周期，而目前国内建立的猴疟动物模型主要是从国外引进的间日型疟原虫，如中国医学科学院建立的食蟹猴疟原虫属于间日型猴疟(张家埙等.一种猴疟原虫的鉴定报告.动物学报，1980，26：140.)，又如二军医建立的猴疟模型(戴祖瑞等.食蟹猴疟原虫B株-斯氏按蚊-恒河猴猴疟模型在国内的建立.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1987，5(3)：197-198)，同样属于间日型猴疟。因此，这给深入研究不同类型疟疾及其免疫带来了困难，也阻碍了针对性抗疟药物的开发进程。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种成本低廉、操作简便、重现性好、易于保种的三日型猴疟动物模型及其建立方法，为深入研究三日型疟疾奠定了基础，也为设计或筛选针对性抗疟药物提供了可靠依据。

为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案：通过猪尾猴疟原虫CCTCC NO.V201021感染健康猴或免疫缺陷猴。

三日型猴疟动物模型的建立方法，该方法包括如下步骤：

<1>取猪尾猴疟原虫CCTCC NO.V201021保种猴静脉血输血感染免疫缺陷猴；

<2>对步骤<1>被血传感染的免疫缺陷猴进行饲养观察，当采血镜检发现血内疟原虫配子体计数达64个/100WBC且雄雌配子体比例为1∶2时，从感染猴静脉取血并抗凝而后给大劣按蚊雌蚊吸血感染；

<3>将步骤<2>吸血大劣按蚊雌蚊饲养观察，当在解剖镜下解剖发现吸血蚊唾液腺中出现成熟子孢子后，取感染蚊自然感染健康猴；

<4>按蚊感染健康猴后饲养观察，当采血镜检监测发现红细胞内有疟原虫即得。

步骤<3>中出现成熟子孢子的时间为大劣按蚊吸血感染后第11～13天。

三日型猴疟动物模型的建立方法，该方法通过抽取带有猪尾猴疟原虫CCTCCNO.V201021保种猴的感染血并抗凝后，经静脉注入健康猴体内，感染3-5天后血检健康猴发现血内有疟原虫即得。

三日型猴疟动物模型的建立方法，该方法采用复苏后的猪尾猴疟原虫CCTCCNO.V201021保种猴静脉血，经静脉注入健康猴体内，感染3-5天后血检健康猴发现血内有疟原虫即得。

复苏是取液氮冻存的猪尾猴疟原虫CCTCC NO.V201021保种猴静脉血冰冻管，放入36℃的水浴箱中，待10-15分钟冰冻管回温即可。

保种猴静脉血的制备是从患病猴静脉取血利用肝素抗凝后，采用无菌含30％甘油与抗凝血按1∶1比例混匀后，分装入1.5毫升的冰冻管中，冻存于液氮罐中保种备用。

本发明采用的猪尾猴疟原虫系中国广西境内发现的一株野外自然界的猪尾猴疟原虫，通过将其感染给人工饲养的中国海南岛大劣按蚊(Anopheles dirus)，再由按蚊传染给健康猴，经生物学观察和分子生物学试验鉴定属猪尾猴疟原虫种(Plasmoium inui)即三日型猴疟原虫，并定名为猪尾猴疟原虫中国株H(Plasmodium inui-China Huang)。