[发明专利]鉴别猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒传统毒株和高致病毒株的荧光PCR检测方法

权利要求书

1.鉴别猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒传统毒株和高致病毒株的荧光PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)准备材料

提供已克隆PRRSV高致病性毒株TJ-H1和传统毒株TJ-H3的nsp2基因的质粒TJ-H1nsp2-T和TJ-H3 nsp2-T，并提取该质粒的DNA；

(2)设计引物

运用DNAMAN软件对nsp2基因缺失的PRRSV高致病性毒株TJ-H1与传统株TJ-H3的nsp2基因的核苷酸序列和GenBank数据库中其他株PRRSV的nsp2基因序列进行比对，找出缺失部分的核苷酸序列和所有参与比对的PRRSV株的nsp2基因序列高度保守区域，利用Primer Premier5.0引物设计软件，在缺失区域上游的高度保守区域设计一条上游引物nsp2-1，在缺失区域设计一条下游引物1nsp2-2，在缺失区域下游的高度保守区域设计一条下游引物2nsp2-3；

(3)PCR反应体系及其反应程序和参数的优化

分别以TJ-H1 nsp2-T和TJ-H3 nsp2-T质粒DNA为模板，对退火温度、循环次数、引物浓度及双重PCR反应中三条引物的最佳浓度配比进行优化，确定PCR反应的最佳条件；

(4)检测最佳PCR反应条件下的PCR反应特异性和敏感性

利用步骤(3)优化的PCR反应的最佳条件，以TJ-H1nsp2-T和TJ-H3nsp2-T质粒DNA为模板，各自分别用nsp2-1，nsp2-2引物对、nsp2-1，nsp2-3引物对和nsp2-1，nsp2-2，nsp2-3引物对进行扩增，确定PCR反应的特异性；

将TJ-H1nsp2-T质粒DNA进行10倍梯度稀释后作为模板，各自用nsp2-1，nsp2-3引物对进行扩增；以及将TJ-H3 nsp2-T质粒DNA进行10倍梯度稀释后作为模板，各自分别用nsp2-1，nsp2-3引物对、nsp2-1，nsp2-2，nsp2-3引物对进行扩增，确定PCR反应的灵敏性；

(5)实时荧光定量聚合酶链反应，建立标准曲线

利用步骤(3)优化的PCR反应体系，将已知拷贝数的TJ-H3nsp2-T质粒DNA进行10倍梯度稀释作为模板，各自分别用nsp2-1，nsp2-2引物对、nsp2-1，nsp2-3引物对和nsp2-1，nsp2-2，nsp2-3引物对进行实时荧光定量PCR扩增；以及将已知拷贝数的TJ-H1nsp2-T质粒DNA进行10倍梯度稀释作为模板，各自用nsp2-1，nsp2-3引物对进行实时荧光定量PCR扩增，扩增反应的程序和参数为：95℃10min，1个循环；95℃15s，57℃45s，40个循环，得到相应的熔解曲线，最后进行标准曲线的绘制；

(6)未知样本的检测

用总RNA提取试剂提取待测样本细胞的总RNA，焦碳酸乙二酯水溶解后置-40℃冰箱备用，以该总RNA的反转录产物作为模板，利用步骤(3)优化的PCR反应体系，用nsp2-1，nsp2-3引物对进行SYBR Green实时荧光定量PCR反应，扩增反应的程序和参数参数为：95℃10min，1个循环；95℃15s，57℃45s，40个循环，检测结果与步骤(5)中建立的标准曲线进行比较，并根据其熔解曲线鉴别该样本是否为PRRSV高致病性毒株TJ-H1。

2.根据权利要求1所述的荧光PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中所述缺失部分的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.1所示；缺失部分上游的高度保守区域的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.2所示；缺失部分下游的高度保守区域的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.3所示；扩增所用的引物如下：

上游引物nsp2-1的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.4所示；

下游引物1nsp2-2的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.5所示；

下游引物2nsp2-3的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.6所示。

3.根据权利要求1或2所述的荧光PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(3)的PCR反应的最佳条件如下：50μL PCR反应体系为：10×Buffer(含MgCl₂25mM)5μL，模板DNA 1μL(3copies/μL)，上游引物(25pmol/μL)1μL，下游引物(25pmol/μL)1μL，dNTPs(每种10mmol/L)1μL，TaqDNA聚合酶(2.5M/μL)1μL，双蒸水补至50μL；双重PCR反应的50μL反应体系为：上游引物(25pmol/μL)1μL，下游引物1(25pmol/μL)0.5μL，下游引物2(25pmol/μL)1μL，其他同上；反应程序及参数为：94℃3min，1个循环；94℃40s，55℃30s，72℃30s，共5个循环；94℃40s，57℃30s，72℃30s，共30个循环；72℃8min，1个循环；4℃3min。