[发明专利]一种双加氧酶基因及其克隆表达和对芘和苯并[a]芘的转化

说明书

技术领域

本发明属于环境有机污染物微生物修复技术领域，具体涉及为一种双加氧酶基因及其克隆表达和对芘和苯并[a]芘的转化。

背景技术

多环芳烃是一类在环境中广泛存在的有机污染物，其中许多种类都具有致癌、致畸、致突变的“三致”效应。而高环多环芳烃因其具有更低的水溶性和更强的吸附性，使之在环境中生物有效性不高，从而导致持久性残留。在自然环境中，多环芳烃的主要消除方式是微生物降解，包括真菌和细菌的作用。真菌对多环芳烃的降解并不彻底，往往只是将其转化成一水溶性更高的产物。相对真菌而言，细菌则具有可以将多环芳烃彻底矿化成二氧化碳的能力，因此更具修复潜能。

细菌矿化多环芳烃是一个由多种酶类共同参与的生物化学代谢过程。其中涉及到双加氧、脱氢、开环双加氧等多种生化反应。在这个矿化途径中，由双加氧酶所催化的双加氧步骤是多环芳烃矿化过程中的第一步，也是多环芳烃矿化中的限速步骤。因此多环芳烃双加氧效率控制着整个多环芳烃的矿化过程。因此，获取对高环多环芳烃进行双加氧作用的双加氧酶具有重要的理论研究和实际应用的意义。

发明内容

本发明的技术目的在于克隆可转化高环多环芳烃的双加氧酶基因，将该酶进行表达并利用工程菌验证其对芘和苯并[a]芘的转化作用。

为了实现本发明的技术目的，本发明的技术方案在于：

一、一种双加氧酶基因，其特征在于该酶基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；其对应的氨基酸序列由SEQ ID NO：2所示的小亚基序列和SEQ ID NO：3所示的大亚基序列组成。

二、本发明所述双加氧酶基因的克隆与表达，具体包括以下步骤：

（1）以芘降解菌分支杆菌Mycobacterium sp. NJS-P基因组为模板，根据现有技术的双加氧酶保守序列，设计简并引物，通过PCR技术扩增出包含双加氧酶基因完整阅读框的基因片段，进行TA克隆，进行测序；再设计引物，从包含双加氧酶基因完整阅读框的TA载体中扩增出双加氧酶基因完整阅读框，得到如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，其对应的氨基酸序列由SEQ ID NO：2所示的小亚基序列和SEQ ID NO：3所示的大亚基序列组成；

（2）将含有双加氧酶基因完整阅读框的TA载体进行酶切，与同样酶切的pET15b表达载体进行连接，构建得双加氧酶表达载体pdoAB-15b；然后再将质粒pdoAB-15b和提供电子载体蛋白的pBRCD共转化于大肠杆菌BL21(DE3)，构建基因工程菌，在培养基中诱导表达出PdoAB可溶性蛋白，即为本发明所述的双加氧酶。

三、本发明所述的工程菌对芘和苯并[a]芘的转化。

具体方法为：

1)                    离心收集经过蛋白诱导的工程菌，用约1/10体积的M9培养基清洗并重新悬浮菌体；

2)                    按10%的量将重悬菌体接入硅油-水双相体系中，其转化体系组分包括25 mL M9培养基(含有氨苄青霉素和庆大霉素)和5 mL含100 mg/L的芘或50 mg/L的苯并[a]芘；

3)                    28℃培养2天。

本发明的有益效果在于：

本发明所涉及的转化方法为全细胞转化体系，免除了酶的提取步骤；而且本发明获取的双加氧酶不仅能够转化四环多环芳烃-芘，而且还能转化五环的苯并[a]芘，在高环多环芳烃的基因工程菌修复研究方面具有一定研究价值。

附图说明

图1为本发明所述的的双加氧酶对芘的转化质谱检测图。

图2为本发明所述的双加氧酶对苯并[a]芘的转化质谱检测图。

具体实施方式

实施例中所涉及基因操作方法参照《分子克隆实验指南》（第三版，J.萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔著，黄培堂等译，科学出版社）

实施例1

本实施例说明本发明的双加氧酶基因序列的获得方法。