[发明专利]一种裂褶菌的培养方法

说明书

本申请是申请号为：200810247561.6、申请日为2008年12月30日、发明名称为《裂褶菌蛋白提取物及其制备方法和应用》的专利申请的分案申请。

技术领域

本发明属于植物病害防治领域，具体地说涉及裂褶菌蛋白提取物及其制备方法和应用；此外，还涉及裂褶菌的培养方法和培养基。

背景技术

植物病毒病类似人类的癌症，目前尚无十分有效的防治方法。烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)是最具经济重要性的病毒之一，能侵染茄科、葫芦科、十字花科等300多种植物，并引起严重危害，植物病毒病防治通常依靠育种和化学药剂的方法解决，但效果都不理想，前者受限于抗病基因的来源，后者则效果差，同时会造成环境污染等问题。近年来，随着人们对环境的重视，化学药剂的应用受到了限制，而环境友好型的生物源抗植物病毒药剂受到重视。

裂褶菌(Schizophyllum communeFr)又称白参、树花，属于真菌门，担子菌亚门、层菌纲、非褶菌目、裂褶菌科、裂褶菌属。裂褶菌广布于世界各地，我国大部分地区都有分布。近年来，日本及欧美等国主要从分子生物学、抗癌活性物质和优良菌株的选育等方面对裂褶菌进行研究，我国的研究则集中于裂褶菌的发酵条件、人工驯化栽培和药用价值。裂褶菌中含有多种抗菌消炎、抗肿瘤，抗辐射等活性物质，但其应用研究多集中在医学领域，而在抗植物病毒方面的作用未涉及到。

专利《裂褶菌的培养工艺及其利用》(专利号ZL85103492)公开了用黄豆粉、葡萄糖或蔗糖、酵母膏、硫酸镁、磷酸二氢钾等组成的培养基培养裂褶菌的方法，提高菌丝体及裂褶多糖的得率，并从裂褶菌中提取抗肿瘤、抗放升白及调整机体免疫功能、生产抗菌素增效剂的裂褶菌多糖和人体必需的氨基酸。在这种液体培养工艺下，每升发酵菌液含200-300g菌丝体(湿重)，但是其产量仍然较低。

发明内容

本发明第一目的是提供一种能防治烟草花叶病毒的裂褶菌蛋白提取物。

本发明第二目的是提供上述裂褶菌蛋白提取物的制备方法。

本发明第三目的是提供裂褶菌的培养方法。

本发明第四目的是提供用于培养裂褶菌的培养基。

本发明第五目的是提供裂褶菌蛋白提取物在防治烟草花叶病毒上的用途。

实现本发明的技术方案如下：

裂褶菌蛋白提取物，按照如下方法制备：

(1)按照重量体积比为1∶10～20的比例将裂褶菌菌丝粉与pH 7.0～9.0的磷酸缓冲液(PBS)混合，然后在2～6℃浸提1～3h，再在4℃、7000～10000rpm条件下离心15～25min，收集上清液，得到裂褶菌粗提液；

(2)向步骤(1)所得裂褶菌粗提液中加入硫酸铵至饱和度为40％，然后在2～6℃放置6～12小时，再在4℃、7000～10000rpm条件下离心15～25min，收集上清液；

(3)向步骤(2)所得上清液中加入硫酸铵至饱和度为85％，然后在2～6℃放置6～12小时，再在4℃、7000～10000rpm条件下离心15～25min，所得沉淀即为裂褶菌蛋白提取物。

上述裂褶菌蛋白提取物的制备方法，包括如下步骤：

(1)按照重量体积比为1∶10～20的比例将裂褶菌菌丝粉与pH 7.0～9.0的磷酸缓冲液(PBS)混合，然后在2～6℃浸提1～3h，再在4℃、7000～10000rpm条件下离心15～25min，收集上清液，得到裂褶菌粗提液；

(2)向步骤(1)所得裂褶菌粗提液中加入硫酸铵至饱和度为40％，然后在2～6℃放置6～12小时，再在4℃、7000～10000rpm条件下离心15～25min，收集上清液；

(3)向步骤(2)所得上清液中加入硫酸铵至饱和度为85％，然后在2～6℃放置6～12小时，再在4℃、7000～10000rpm条件下离心15～25min，所得沉淀即为裂褶菌蛋白提取物。

所述的裂褶菌菌丝粉的粒径为≤60目。

上述裂褶菌蛋白提取物中所述的裂褶菌的培养方法，包括如下步骤：

(1)裂褶菌母种活化：将裂褶菌母种转接在PDA固体培养基上，然后在24～28℃培养7～10天，得平板活化菌丝；