[发明专利]一种非损伤性提取普氏野马免疫球蛋白IgA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物免疫学领域中一种非损伤性提取普氏野马免疫球蛋白IgA的方法。

背景技术

普氏野马(Equus przewalskii)曾广布于欧亚大陆草原地带，上世纪中叶野外灭绝。现存普氏野马均为西方探险者于十九世纪末在中国和蒙古国西部捕获并运往欧洲圈养的后代。中国于1985年从国外引回该物种并建立了繁育中心。2001年在新疆卡拉麦里自然保护区实施了普氏野马的放归野化。监测和评估重引入物种的生存状态，并实施必要的人工管护，是保证放归物种长期存活和建立野生种群的关键环节，但目前这些方面的工作却开展得很少。究其原因，首先，获取自由生活动物的组织样本十分困难，而且定期或不定期采集研究样本几乎是不可能的；再者，捕捉和采集动物血液样品本身就是一个很强的刺激因子，会严重干扰动物的正常生活。显然，受到样品获取和测定等方面的制约，迄今尚未见放归物种的免疫生理的研究。因此，作为监测动物机体免疫生理的重要指标，免疫球蛋白的提取和检测对放归物种研究尤为重要。

显然，对于监测普氏野马免疫生理状况，传统的抽取血液取样途径已经不再适用，急需要发展一种简单、高效、非损伤提取和检测免疫球蛋白的方法。通常非损伤性取样主要是采集目标动物尿液和粪便，但是普氏野马其活动场地广阔，且多为草地或沙质土地，排出的尿液很快就会渗入地下，不容易收集，并且肾小球滤过膜不能透过球蛋白，因此正常动物尿液中含有的免疫球蛋白很少。胃肠道黏膜固有层可以产生分泌型免疫球蛋白，进入胃肠道的胆汁中也会携带部分来自组织液中的免疫球蛋白。基于这些原因，与采集尿液相比，粪便途径是一个理想的非损伤性检测普氏野马免疫球蛋白的方法。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种提取动物免疫球蛋白的方法。

本发明所提供的一种提取动物免疫球蛋白的方法，包括以下步骤：

将动物粪便与提取缓冲液混合，得到混合物；将所述混合物离心，取上清液，即得到所述动物免疫球蛋白；所述提取缓冲液由PBS缓冲液和吐温-20组成。

所述提取缓冲液中，所述吐温-20的体积百分比浓度为0.01％-0.5％或0.03％-0.07％或0.03％或0.04％或0.05％或0.06％或0.07％。

所述离心的方法包括以下步骤：将所述混合物进行第一步离心，取上清液，记作上清液I；将所述上清液I进行第二步离心；所述第一步离心的转速为2000rpm、温度为25℃和时间为20min；所述第二步离心的转速为10000rpm、温度为4℃或25℃和时间为10min。

在将所述混合物离心前，包括将所述混合物混匀的步骤。

所述混匀的方法为将所述混合物用涡旋仪在1200rpm下振荡10min。

所述PBS缓冲液由氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和水组成，各成分的浓度分别为氯化钠8.5g/L、磷酸二氢钠0.3g/L和磷酸氢二钠2.2g/L。

所述提取缓冲液的pH值为7.2。

所述提取缓冲液的用量为：每1g所述动物粪便中加入10mL所述提取缓冲液。

所述动物粪便为混匀后的动物粪便。

所述动物为普氏野马；

所述免疫球蛋白为免疫球蛋白IgA。

本发明提供了一种非损伤性提取普氏野马免疫球蛋白的简单、高效的方法。通过采集普氏野马新鲜粪便，将新鲜粪便溶于添加有一定浓度Tween-20的提取缓冲液中，进行两步离心取上清液，即可提取得到较高浓度的普氏野马免疫球蛋白。此方法操作简单且提取效率较高。

附图说明

图1为含有不同浓度Tween-20的提取缓冲液对普氏野马粪便中IgA提取量的影响。

图2为鱼精蛋白对普氏野马粪便中IgA提取量的影响。

图3为不同离心温度对粪便IgA提取量的影响。

图4为标准品孔的IgA浓度与OD值的标准曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、非损伤性提取普氏野马免疫球蛋白及其检测

一、吐温浓度对普氏野马粪便中免疫球蛋白提取量的影响

(一)非损伤性提取普氏野马免疫球蛋白

1、采集粪样