[发明专利]一种重组鸡β干扰素的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子免疫学技术领域，具体涉及一种体外高效制备鸡β干扰素的方法及其应用。

背景技术

β干扰素是一种重要的I型干扰素，主要是由成纤维细胞和白细胞在病毒核酸、多聚肌苷酸多聚胞苷酸( Poly IC)等干扰素诱生物质刺激下所分泌的一种糖蛋白。β干扰素不仅在抗病毒固有免疫过程中发挥着重要作用，而且具有抗肿瘤、抗增殖和免疫调节等功能。在一些α干扰素使用失败的病例（多发性硬化症）或效果欠佳的病例（严重急性呼吸综合症,SARS）中，β干扰素能够发挥非常好的效果。

从β干扰素的科研价值和临床应用的价值来推测，鸡β干扰素在鸡相关疾病的防制和科研研究中必将会起一定的作用。但是要使鸡β干扰素在兽医临床上和基础研究中得到应用，必须先获得在体外大量生产鸡β干扰素的能力。

目前，在国内，鸡干扰素相关的研究中，鸡β干扰素的研究还很少，现有的研究有：内蒙古农业大学的关平原教授实验室的银晓博士对鸡β干扰素的基因进行了克隆，并采用pGEX-2T载体对其进行了融合表达。但是鸡β干扰素是一种生物活性物质，融合表达的鸡β干扰素其生物活性会受到很大影响。另外，南京农业大学陈伟业博士在CHO细胞中表达了鸡β干扰素基因。一般来说，用真核细胞表达的外源蛋白具有生物活性好的优点，但是也存在表达量少的缺点，且研究表明利用真核细胞宿主系统达到鸡β干扰素产业化生产，需要企业有严格的细胞培养条件和培养环境，并需要付出昂贵的细胞培养成本，不利于工业化生产。

发明内容

（一）本发明要解决的技术问题是：提供一种可用于工业化生产，生产成本低，生产效率高，可用于动物医学基础研究和临床应用的鸡β干扰素的体外制备方法，以弥补目前国内商品化鸡β干扰素的空白。

（二）本发明的技术方案是：

1 鸡β干扰素成熟蛋白基因的克隆：

从国内鸡场购买三黄鸡，取鸡肝的全基因组。以GenBank上公布的鸡β干扰素的基因序列为原始模板，利用分子生物学软件Primer Primer 5.0设计一对引物，用于扩增出鸡β干扰素成熟蛋白基因。

2 含有鸡β干扰素成熟蛋白基因原核表达载体的构建与鉴定

利用PCR的方法扩增的鸡β干扰素成熟蛋白基因的前后两端的酶切位点，把鸡β干扰素成熟蛋白基因与同样用上述两种限制性内切酶酶切的PET28a表达载体相连，连接产物在大肠杆菌中增殖后，转化菌培养后重新提取的质粒经酶切后电泳，能获得大小为531bp条带的质粒可以鉴定为已连接上鸡β干扰素成熟蛋白基因的重组载体(PET28a-chIFNβ)。

4 含鸡β干扰素成熟蛋白基因重组载体是否能在大肠杆菌中表达的鉴定

把PET28a载体和PET28a-chIFNβ重组载体分别转化BL-21宿主菌，在IPTG加入后进行诱导，并通过SDS-PAGE来鉴定鸡β干扰素成熟蛋白基因是否能在大肠杆菌中进行高效表达。

5 大肠杆菌表达的鸡β干扰素包涵体的制备、变性、纯化与复性工艺的探索

  对大肠杆菌表达的鸡β干扰素的包涵体用一些去污剂洗涤处理初步纯化后，再用高浓度变性剂的处理，使其溶解在尿素中，然后利用大肠杆菌表达的鸡β干扰素末端6个组氨酸的标签，通过NI-NTA层析柱进行亲和层析纯化，使其浓度进一步提高，达到作为标准品和商品化生产的要求。在此工程中，确定具体的操作条件和溶液

6大肠杆菌表达的鸡β干扰素生物活性的测定

采用国际上通用的微量病变抑制法来测定在大肠杆菌中高效表达后处理之后，是否具有抗病毒的生物学活性。

本发明中采用的是本实验室从当地三黄鸡中克隆的鸡β干扰素成熟蛋白的基因序列如下：

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