[发明专利]日本蟳Jassr129微卫星DNA标记的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于日本蟳微卫星DNA分子遗传标记技术，具体说是一种日本蟳Jassr129微卫星DNA标记的检测方法。

背景技术

本发明做出之前，国内外在其他蟹类中有相关的研究报道，Pamela C.Jensen等在对邓杰内斯蟹(Cancer magister)的研究中，设计了99个微卫星引物，并对其中的9个进行了合成。利用尼龙膜杂交法，Masatsugu takhano等在锯缘青蟹(正蟳，Scylla serrata)中发现5个具有可变性的微卫星位点。David Gopurenko等在锯缘青蟹(沙蟳，Scylla paramamosain)的研究中筛选到5个微卫星位点。利用常规方法，E.S Yap等在远海梭子蟹(Portunus pelagicus)中筛选到7个含有二核苷酸重复单元、1个含有四核苷酸重复单元的微卫星位点。H.S.AN等利用PCR筛选法，在中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)基因组富集文库中筛选出9个新的微卫星位点。B.等在中华绒螯蟹中筛选到12个具有高度多态性的微卫星位点。国内的宋来鹏、李晓萍等从基因组文库和微卫星富集文库中筛选了30多个多态性的微卫星标记，并进行了标记多态信息含量做出了评价；刘磊等应用这些标记进行了家系鉴定的系谱认证分析；罗云等将这些标记应用到日本蟳遗传图谱构建中。至今为止，尚未见有关日本蟳微卫星DNA检测技术方面的报道。

微卫星(microsatellites)或称简单序列重复(simple sequence repeats，SSR)是指由1～6个核苷酸组成的简单串联重复DNA序列。迄今研究过的所有生物种类中都发现了它的存在，并且分布密度很大。由于微卫星广泛分布于基因组中，具有密度大、多态性丰富、高度杂合且稳定性好、遵循孟德尔分离定律共显性遗传、易于PCR扩增等特点，已成为近年来最引人注目的新型DNA标记，并广泛应用于生物资源的家系谱系认证、基因连锁分析、遗传图谱构建、种质鉴定、种群遗传多样性等许多研究领域。

发明内容

本发明是针对目前尚未有对日本蟳微卫星DNA检测技术公开的现状，提出一种日本蟳Jassr129微卫星DNA标记的检测方法，可快捷的获得日本蟳的Jassr129遗传标记基因座位呈现高度遗传变异的多态性图谱，方法简便，所得结果可直观地检测出日本蟳在此位点的每个个体的基因型。

本发明检测技术主要利用磁珠富集法建立的日本蟳微卫星富集文库中Jassr129的微卫星DNA序列，使用Primer(Version 5.00)软件在其核心序列的两端设计相应的PCR引物，将引物序列合成后对日本蟳个体进行PCR扩增，从而快速地检测日本蟳每个个体在此微卫星区的遗传变异，从而获得该引物对日本蟳在Jassr129序列区的遗传变异图谱，通过该图谱直观地表现出每个个体的基因型。

本发明的技术方案是：一种日本蟳Jassr129微卫星DNA标记的检测方法，其特征在于，操作程序为：首先提取日本蟳基因组DNA并稀释备用；再利用日本蟳基因组文库中的Jassr129微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对日本蟳不同地理群或群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶检测；利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，从而获得日本蟳在Jassr129核心序列区高度遗传变异的多态性图谱；Jassr129微卫星核心序列的特异性引物序列分别为：正链5’-CATTACGCTCGGAAAGTG-3’，负链3’-TTCAGCAGCACAACCTCT-5’，使用该引物时的退火温度为49℃。

对上述技术方案的改进：提取日本蟳基因组DNA，将其稀释为50ng/μL，每个PCR反应中加入3μL，反应总体积为20μL。

对上述技术方案的进一步改进：所述PCR扩增的加样参数为：每个PCR反应总体积为20μL，包括50ng日本蟳基因组DNA3μL；含15mmol/L Mg²⁺的10X PCRBuffer2.0μL；2.5mmol/L dNTP 1.6μL；5U/μL的Taq0.2μL；本发明的引物10mmol/L各1μL；最后加ddH₂O至20μL；使用该引物时设置PCR仪的程序参数为：95℃预变性5min；95℃变性45s，49℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环；最后72℃再延伸10min；4℃保存。