[发明专利]治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的制剂及其制备方法

权利要求书

1.一种治疗外周动脉粥样硬化引起的缺血性疾病的制剂的制备方法，其特征在于，该制剂的制备方法包括如下步骤：

1)从健康人血液中通过白细胞置换获取外周血单核细胞，或从骨髓中(通过密度梯度离心的方法，可选步骤)获取骨髓单核细胞，或从人脂肪吸取物中直接提取MSC；

2)筛选及培养外周血或骨髓单核细胞以获得MSC细胞；

3)在特定条件下培养MSC细胞使其分泌促组织修复和再生的生长因子和细胞活素，分离MSC细胞和培养基，获得富含促血管生成因子和细胞活素的无细胞培养基；

4)对步骤3)中所获得的无细胞培养基进行后处理，该后处理步骤包括：过滤细胞碎片、纯化该无细胞培养基、检测各有效生长因子的成分及含量、对该培养基进行冻干处理或冷冻保存，即获得促进创伤愈合的制剂。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的健康人血液或骨髓的来源可以是自体来源或异体来源，获得途径可以是直接骨髓抽取或者外周血液中提取，或由血库直接购买的健康人外周血白细胞悬液样本，或通过临床白细胞置换。

3.根据权利要求1-2任一所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的从血液中或骨髓中通过密度梯度离心获取外周血单细胞的方法为：使用梯度剂为Ficoll-Paque、Histopaque-1077或其他同类产品，温度为15～25℃，离心力为200g-500g，时间20-40分钟，离心完成后，吸取当中不透明层，即为单核细胞悬液。

4.根据权利要求1-3任一所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中的培养单核细胞以获得MSC细胞时，所用的培养基为M119、DMEM、F12、RPMI-1640中的一种，并添加有heparin(0-100U/ml)，培养基中另可含有质量比为5％至20％的胎牛血清或者人血清白蛋白或自体血清，在预设条件为培养温度37℃，二氧化碳浓度为5-7％的细胞培养箱中培养。

5.根据权利要求1-4任一所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述的培养单核细胞以获得MSC细胞的方法为以下所述方法①、②、③或④中的一种：

方法①：将单核细胞以每平方厘米5×10⁵至2×10⁶个细胞的密度培养1-2天，去除悬浮细胞，将贴壁的细胞继续培养7-21天，获I型MSC。

方法②：将单核细胞与fibrin微球共同培养1-2天，每100-1000mg fibrin微球可吸附1×10⁶至1×10⁸个细胞的密度，去除悬浮细胞，将附着于fibrin微球的细胞继续培养7-21天，获I型MSC。

方法③：将单核细胞通过CD14，或CD45特异性抗体进行磁珠分选，筛选出不含CD14或CD45的单核细胞亚群，将此CD14^-或CD45^-单核细胞亚群以每平方厘米5×10⁵至2×10⁶个细胞的密度培养1-2天(或用方法②培养)，去除悬浮细胞，将贴壁(或附着于fibrin微球)的细胞继续培养7-21天，获II型MSC。

方法④：将人脂肪吸取物50-100ml在pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)或0.9％的医用生理盐水中洗净，用I型和II型胶原酶消化(酶的浓度范围0.05％-0.1％)，消化步骤为置于37℃条件下震荡30-60分钟。将消化分散后的单核细胞以每平方厘米5×10⁵至2×10⁶个细胞的密度培养1-2天(或用方法②培养)，将贴壁(或附着于fibrin微球)细胞继续培养7-21天，获III型MSC。