[发明专利]大麦木糖异构酶基因的功能及其应用

说明书

技术领域：

本发明涉及大麦木糖异构酶基因转化木糖为木酮糖的功能，本发明还涉及含该基因的重组质粒及工程菌株，以及用该工程菌通过发酵含有木糖的培养基制备乙醇和其他发酵产物的应用。

背景技术：

植物的木质纤维素中可发酵糖主要为葡萄糖和木糖，后者占木质纤维素的25％。但是，大部分能够发酵葡萄糖以制备乙醇的酵母(如酿酒酵母)不能够以木糖作为碳源。如果能够将植物的木质纤维素中的木糖异构化，生成木酮糖，木糖就可以作为碳源进行乙醇发酵。而若能找到高效的木糖异构酶(D-xylose isomerase，XI)，催化五碳糖D-木糖转化为D-木酮糖，便可达到此目的。

现有技术的木糖异构酶基因多来自于微生物。如Escherichia coli，Bacillus subtilis，Thormotoga species，Thermus species等等。但迄今为止只有少数几种且多为嗜热细菌的木糖异构酶基因在乙醇生产传统菌株酿酒酵母中得到活性表达，而且在30℃左右的乙醇发酵温度下普遍由于活性太低而成为木糖代谢途径的限速步骤。

因此，发现新的可在酿酒酵母里高效表达的木糖异构酶，提供能够转化木糖生成木酮糖的酵母工程菌，并能克服现有技术的限制，即在30℃左右的乙醇发酵温度下具有足够的酶活，很有必要。

发明内容

本发明的目的是从大麦中筛选出新的木糖异构酶基因，并将该基因导入酿酒酵母，使所得到的酵母遗传工程菌获得将木糖转化为木酮糖的能力。

本发明人通过分析数据库大麦基因组序列的方式，首次从大麦基因组序列中发现了具有木糖异构化功能的基因(GenBank NO.X95257)，并将其命名为“大麦木糖异构酶基因”。并通过实验发现，该基因编码的木糖异构酶在宿主细胞中表达后，赋予宿主细胞将木糖转化为木酮糖的能力。

现有技术的文献仅在转录水平上证实了基因(GenBank NO.X95257)的存在，但未公开过其所具有的任何功能，以及可利用该基因做何种用途的研发。

本发明构建了具有大麦木糖异构酶基因的重组质粒，并将该质粒导入了酿酒酵母中，获得了一种新的酵母工程菌。经实验证实，原来不具备转化木糖为木酮糖的能力的酿酒酵母赋予了该转化能力。

本发明进行了如下具体工作：

1.提取大麦mRNA，反转录生成cDNA，用保守引物克隆得大麦木糖异构酶基因，其大小为1443bp。

2.将大麦木糖异构酶基因片段连接到pYES2质粒载体中，构建具有完整木糖异构酶基因的重组质粒pYES-WXI。

3.将含大麦木糖异构酶基因的重组质粒pYES-WXI通过电击转化方法导入不具将木糖转化为木酮糖的能力的酿酒酵母中，获得能够将木糖转化为木酮糖的遗传工程酵母菌株W(详见实施例5)。

因此本发明的木糖异构酶基因有益效果是：大麦木糖异构酶基因赋予宿主细胞将木糖转化为木酮糖的能力。且大麦木糖异构酶基因工程菌株的木糖利用率可达51.78％，大大高于对照菌株(详见实施例6)。

具体实施方式

以下实施例中所举的质粒、菌株只是用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。实际上，用本发明发现的基因和方法，本领域技术人员可以得到其它多种具有将木糖转化为木酮糖能力的遗传工程菌株，均不能脱离本发明的精神和思路。

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

试验材料和试剂

1、菌株及载体：酿酒酵母表达载体pYES2购自Invitrogen公司，酿酒酵母菌株CEN.PK113-5D(表型为：MatA ura3-52)及大肠杆菌DH5α由所在实验室保存。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶及连接酶购自NEB公司，其它试剂如未作具体说明都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(1)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)；

(2)酵母培养基YPD(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖，平板添加2％琼脂)；

(3)选择培养基SC(0.67％YNB、2％葡萄糖，平板添加2％琼脂)。

实施例1获取大麦cDNA

(一)植物总RNA提取-Trizol法