[发明专利]一种抗HIV融合多肽CP32M的固液混合策略规模制备方法

说明书

技术领域：

本发明涉及抗HIV融合多肽CP32M的制备方法，尤其涉及固-液相混合策略合成CP32M的制备方法。

背景技术：

据世界卫生组织和联合国艾滋病规划署(http://www.unaids.org)的估计，全世界已有六千多万人感染HIV病毒，超过2500万人死于艾滋病，研制其治疗药物具有重要意义。

目前治疗爱滋病药物主要是逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂，但耐药性及副作用是其突出问题。近年来病毒融合抑制剂及整合酶抑制剂进入临床，降低了毒性。2003年上市的唯一基于HIV表面融合蛋白gp41靶点的抑制剂Fuzeon对逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂耐药及不耐药病人均具有很好的治疗效果，且副作用低(Tom Matthews et al.Nature reviews，2004，3：215-25.)。然而Fuzeon存在用量偏大，耐药性产生快等不足(Yuxian He，Jianwei Chen，Qiuyun Dai.PNAS，2008，105(42)：16332-7.)。

CP32M是申请人设计的新型抗gp41融合多肽(Ac-VEWNEMTWMEWEREIENYTKLIYKILEESQEQ-NH2)(Yuxian He.Jianwei Chen，Qiuyun Dai.PNAS，2008，105(42)：16332-7.)。该肽具有如下突出特征：(1)作用活性比Fuzeon高得多；(2)对T-20、C34病毒耐株非常有效；(3)对O型HIV-1BCF02有特效(IC50为11.6nm)；(4)耐药性低；(5)CP32M的氨基酸序列与Fuzeon、C34及国内的扶素肽Fuserox的同源性仅28％、47％、63％，且只含32个氨基酸，合成相对容易，成本降低。CP32M及相关肽已获得国家发明专利(ZL200610087074.9)

目前多肽合成主要采用逐步合成法，即保护氨基酸逐个连接于树脂，然后通过肽树脂的切割、脱保护而得到目标肽。常用的多肽合成方法主要有Fmoc保护和Boc保护策略。目前绝大部分多肽合成采用Fmoc保护策略，即脱保护采用哌啶，树脂切割采用三氟乙酸(TFA)混合体系，该法比Boc法优越，因为Boc法中每步脱除Boc均需用TFA，肽树脂切割采用刺激强烈、剧毒的氟化氢。

长肽的规模合成主要有两种方法，即单一的逐步合成法，适用于肽链少于30个氨基酸的多肽。而更长的多肽需采用采用固-液相混合策略(Brian L.Bray.Large-scale manufacture of peptide therapeutics by chemical synthesis.Nature，2003，2：587-93.)，该法先合成带侧链保护的多个肽片段，片段再进行液相缩合得到目标肽，此法可以大大提高长肽的合成效率，减少保护氨基酸的用量。固-液相混合策略规模合成长肽的关键是片段的选择，要防止片段缩合时出现消旋及耦合效率低的问题。肽片段的长度一般为数个至十几个氨基酸，不宜过长。缩合片段应尽量符合以下要求：①尽量选用非光活性或消旋风险最小氨基酸；②全保护肽片段在有机溶剂中如DMF(N，N-二甲基甲酰胺)、NMP(N-甲基吡咯烷酮)中具有很好的溶解性；③片段纯度高(王德心.固相有机合成：原理及应用指南.北京：化学工业出版社，2004：114-115.)。最佳片段的选择还应根据具体序列，通过试验确定各片段的合成效率及液相缩合效率来确定。

多肽的纯化方法一般有离子交换色谱、反相高效液相色谱。离子交换色谱有分辨率高、分辨容量大、易于放大等特点，根据多肽杂质的电荷差异加以分离。反相高效液相色谱根据多肽的疏水性差异加以分离。

发明内容：

本发明的目的是提供一种含32个氨基酸的抗HIV融合多肽CP32M的固液相规模制备方法。