[发明专利]利用环化RNase H检测基因多态性SNP位点的方法

权利要求书

1.一种利用环化RNase H检测基因多态性SNP位点的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、纯化N端含有寡聚甘氨酸、C端含有转肽酶Sortase A识别序列的线性APE RNaseHII；

步骤二、环化N端含有寡聚甘氨酸、C端含有识别序列的线性APE RNase HII：转肽酶Sortase A与线性的APE RNase HII在标准反应缓冲液并温浴24h；

步骤三、鉴定环化RNase H的热稳定性，环化的RNase H与未环化的RNase H经不同的温度加热处理后，鉴定其酶学活性；

步骤四、合成具有茎环结构的两端含有荧光基团及淬灭基团的探针，探针5’末端及3’末端为互补序列，剩余的探针序列与待测单链DNA的SNP位点两侧核苷酸配对；

步骤五、设计合成用于扩增目的DNA的特异性正向引物和反向引物，PCR扩增目的DNA；

步骤六、利用合成的探针及环化的RNase H，在Steponeplus仪上进行PCR反应，测定待测单链DNA待测位点的单核苷酸多态性。

2.根据权利要求1所述的利用环化RNase H检测基因多态性SNP位点的方法，其特征是，所述的第一步具体步骤包括：

1.1)设计特异引物对表达载体pTWIN的多克隆位点进行突变，将酶切位点Not I前的氨基酸序列突变为寡聚甘氨酸，其中：

突变正向引物：ACTTTGTCGCGAATGACATCATTGTACACAACGGAGGAGGAGG

              AGGCGGCCGCAAA

突变反向引物：CAGGAAGAGCCCTCGAGGAATTCGCGGCGGCCTCCTCCTCCTC

              CGTTGTGTAC

1.2)设计特异引物通过PCR扩增在待环化蛋白质的C端引入转肽酶Sortase A的识别序列LPXTG，其中：

正向引物：GGGGGGAATTCTTGGGCATAGTCGTCGGCGTG

反向引物：GGGGGGGATCCCTATCCGGTTTCTGGTAAACCTCCCAGGAA CTC

          GTCC

1.3)选取突变载体pTWIN中双酶切位点Not I/Bam H I，构建含有Sortase A识别序列的蛋白质亚克隆；

1.4)利用表达的线性融合蛋白质N端含有的CBD标签，通过几丁质纯化柱，非变性纯化N端含有寡聚甘氨酸、C端含有识别序列LPXTG的线性蛋白质，贮存于标准贮存缓冲液中。

3.根据权利要求2所述的利用环化RNase H检测基因多态性SNP位点的方法，其特征是，所述的标准贮存缓冲液含有20mM Tris-HCl以及150mM NaCl且pH 8.0。

4.根据权利要求1所述的利用环化RNase H检测基因多态性SNP位点的方法，其特征是，所述的标准反应缓冲液含有20mM Tris-HCl以及150mM NaCl和10mM CaCl₂且pH 8.0。

5.根据权利要求1所述的利用环化RNase H检测基因多态性SNP位点的方法，其特征是，所述的转肽酶SortaseA与线性的APE RNase HII的浓度比为1∶1的比例。

6.根据权利要求1所述的利用环化RNase H检测基因多态性SNP位点的方法，其特征是，所述的温浴为37℃。

7.根据权利要求1所述的利用环化RNase H检测基因多态性SNP位点的方法，其特征是，所述的特异性正向引物和反向引物为：

正向引物：GCTCCCACTCCATGAGGTATT

反向引物：GGGACAAGGGTCTCGGAGT。

8.根据权利要求1或2所述的利用环化RNase H检测基因多态性SNP位点的方法，其特征是，所述的PCR扩增中PCR反应条件为94℃×5min；(94℃×30s，50℃×30s，72℃×15s)×30循环；72℃×2min，扩增后的DNA片段，经胶回收纯化贮存。

9.根据权利要求1所述的利用环化RNase H检测基因多态性SNP位点的方法，其特征是，所述的第六步具体步骤包括：

6.1)配制反应混合溶液20μL，将反应所需的酶：环化的RNase H、Vent DNA聚合酶，底物：探针、待测DNA片段，特异正向/反向引物，buffer，DEPC H₂O，dNTP等混合均匀，除气泡；

6.2)反应溶液转移至Steponeplus仪进行反应，同时检测DNA的单核苷酸多态性。