[发明专利]一种产丁二酸大肠杆菌基因工程菌株的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种产丁二酸大肠杆菌基因工程菌株的构建方法，具体是一种基于NAD(H)系统改造后的大肠杆菌菌株的构建方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

丁二酸（Succinic acid）又称琥珀酸，被广泛应用于医药、农药、染料、香料、油漆、食品和塑料等行业，作为C4平台化合物，可用于合成1,4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯等有机化学品以及聚丁二酸丁二醇酯（PBS）类生物可降解材料，被美国能源部认为是未来12种最有价值的生物炼制产品之一。

丁二酸的生产方法主要包括化学合成法和微生物发酵法，利用微生物发酵法转化可再生资源（葡萄糖、木糖等），由于原料来源广泛且价格低廉，污染小，环境友好，且在发酵过程中可以吸收固定CO₂，能有效缓解温室效应，开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径，近年来成为研究的热点。丁二酸的生产菌株主要集中在Anaerobiospirillum succiniciproducens、Actinobacillus succinogenes、Mannheimia succiniciproducens、重组谷氨酸棒杆菌和重组大肠杆菌的研究上。利用野生菌株生产丁二酸虽然获得了较高的产物浓度，但培养过程培养基成本较高，且甲酸、乙酸等副产物积累较多，阻碍了其工业化进程。E.coli（大肠杆菌） 由于遗传背景清楚、易操作、易调控、培养基要求简单和生长迅速等优点，近年来被广泛用于研究以获得产丁二酸优秀菌株。

提高丁二酸的发酵产酸能力，可以有多种方法，包括重新筛选优良菌株、通过传统的物理化学方法进行菌种诱变以及用现代遗传育种技术、基因工程方法来提高菌种的产酸能力等。Soon Ho Hong等人报道了构建产琥珀酸基因工程菌的方法，原理是敲除野生大肠杆菌中的丙酮酸甲酸裂解酶基因（pflB）和乳酸脱氢酶基因（ldhA）减少甚至不产副产物甲酸、乳酸、乙酸以及乙醇等，使更多的代谢流流向琥珀酸（Biotechnol Bioeng, 2001, 74: 89～95）。

现有产丁二酸重组大肠杆菌的构建思路主要包括失活副产物生成途径的关键酶（如丙酮酸甲酸裂解酶与乳酸脱氢酶）、增强丁二酸合成途径中酶（如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶）的活性以及外源导入可以引导合成丁二酸的酶（如丙酮酸羧化酶）提高其对葡萄糖的利用率以及生产速率。其中，E. coli NZN111由于同时失活了丙酮酸甲酸裂解酶与乳酸脱氢酶，NADH不能及时再生为NAD⁺，引起胞内辅酶NAD(H)的不平衡（NADH/NAD⁺比例超过2），最终导致厌氧条件下菌株不能利用葡萄糖。其自发突变株E. coli AFP111由于突变了葡萄糖专性转运系统中的ptsG基因，降低了在EMP途径中NADH的产生速率，恢复了NAD(H)平衡，使得菌株在厌氧条件下能够利用葡萄糖，且产物主要为丁二酸，在有氧厌氧两阶段发酵培养AFP111过程中，丁二酸质量收率达到96%，生产强度为1.21 g L^-1·h^-1。因此，在高产丁二酸大肠杆菌菌株构建过程中，确保胞内辅酶NAD(H)的平衡是重组大肠杆菌高产丁二酸的关键因素之一。