[发明专利]一类基于活性的在体标记蛋白酪氨酸磷酸酶的透膜荧光小分子探针的合成和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物分子学领域。

背景技术

基于酶活性的化学小分子探针（Activity-based probes，ABPs）是一种功能性的蛋白质组学的研究工具。经典的探针包括三个部分：反应基团，连接基团与标记基团。反应基团通常是根据靶酶的催化机理设计的一类强吸电子能力的化学小分子，它能够与靶酶的催化中心共价结合，从而起到基于活性的标记的目的。连接基团用来隔开反应基团与标记基团，减小合成中的空间位阻。标记基团用来示踪，便于检测，比如有同位素标记、荧光标记与生物素标记等。传统的ABPs标记目标底物的过程如下：当ABPs暴露在底物中处于合适的标记环境中时，有活性的底物中心会被ABP占据并结合，而非底物或者非活性的底物不能被ABP结合，这样通过一维电泳胶分离，可以达到将底物与背景分离开的目的，再通过酶解，结合蛋白质的质谱技术，就可以检测被标记的底物。

ABPs的优点主要表现在：1)直接从功能角度切入蛋白质研究，而不是仅对蛋白质进行定性定量鉴定。2)可实现基于活性的蛋白质检测，消除了那些没被激活，不具有活性的蛋白质对检测结果的影响。3)分子量小，避免体积过大而有可能影响其在细胞内的分布及与蛋白质的相互作用的问题。4）实验过程简单，可获得的信息量大。

目前，ABPs作为一种功能性的蛋白质组学研究工具已经在多种酶家族中有应用。具体对于蛋白酪氨酸磷酸酶家族来说，其酶家族本身所具有的高分散性、高度依赖于翻译后修饰的活性，以及较大一部分分布于细胞膜上的特点，使得其本身比较适合用这种基于活性的检测方法。但目前，用ABP的方法研究这种酶家族的研究工作进行得相对来说比较少，而且只能在裂解液中标记。这种先将细胞裂解再与探针共孵育的方法，由于其对于活细胞的破坏作用，将丢失一部分信息，得到的信息也会存在失真状况。

发明内容

本发明的目的是解决上述问题而提供了一类基于活性的在体标记蛋白酪氨酸磷酸酶的透膜荧光小分子探针，该小分子探针可以实现在活细胞内目标蛋白的标记。

本发明所采用的技术方案是：

一类基于活性的在体标记蛋白酪氨酸磷酸酶的透膜荧光小分子探针，具有式Ⅰ所示的结构：

Ⅰ

式Ⅰ中，为α-溴苄基亚磷酸，对蛋白酪氨酸磷酸酶有着高特异性的反应基团；为谷氨酸，作为连接基团1，用于引出一个比反应识别基团上的氨基更加活泼的氨基、减小反应识别基团与其它部分连接时的空间位阻以及借助于其侧伸出的基团与树脂相连；为八聚精氨酸，是透膜基团，其作用是携带整个探针进入细胞，赋予探针穿膜功能；为6-氨基己酸，为连接基团2，其作用是是减小透膜基团与荧光基团之前的空间位阻；R为荧光基团，用于示踪。

一类基于活性的在体标记蛋白酪氨酸磷酸酶的透膜荧光小分子探针，其特征在于，具有式Ⅱ所示的结构：

Ⅱ

式Ⅱ中，为带生物素的赖氨酸，是富集基团，其作用是富集目标蛋白后提高信号强度。

一类基于活性的在体标记蛋白酪氨酸磷酸酶的透膜荧光小分子探针Ⅰ的合成方法，包括以下步骤：

1）反应识别基团的合成及修饰：从反应起始物对氰基溴苄开始，利用液相有机合成，得到乙基保护下的反应识别基团，接着采用羧基活化法在其氨基端连入一个谷氨酸，反应式如下：

2）全探针的初步合成：从上述修饰后的反应识别基团开始，选用氨基AM树脂，采用固相Fmoc合成策略，在去掉Fmoc后，依次连接八个精氨酸，6-氨基己酸，荧光基团R，其反应式如下：

3）亚磷酸保护基的去保护：反应识别基团上的乙基Et最后去掉，在切掉树脂与其它保护基之后，要求无水环境，其反应式如下：

一类基于活性的在体标记蛋白酪氨酸磷酸酶的透膜荧光小分子探针Ⅱ的合成方法，包括以下步骤：

1）反应识别基团的合成及修饰：从反应起始物对氰基溴苄开始，利用液相有机合成，得到乙基保护下的反应识别基团，接着采用羧基活化法在其氨基端连入一个谷氨酸，反应式如下：

2）全探针的初步合成：从上述修饰后的反应识别基团开始，选用氨基AM树脂，采用固相Fmoc合成策略，在去掉Fmoc后，依次连接八个精氨酸，带有生物素的赖氨酸，6-氨基己酸，荧光素R，其反应式如下：

3）亚磷酸保护基的去保护：反应识别基团上的乙基（Et）最后去掉，在切掉树脂与其它保护基之后，要求无水环境，其反应式如下：