[发明专利]抑制miR-130b基因表达的siRNA和表达载体及其在制备提高肝癌治疗效果的药物中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及抑制miR-130b基因表达的siRNA和表达载体及其在制备提高肝癌治疗效果的药物中的应用。

背景技术

发明人前期的实验研究已证明了膜表面蛋白CD133可以作为肝癌肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)的分子标记物，用来分选肝癌CSC(Ma et al.，Gastroenterology 132：2542-2556，2007)。最近，比较了CD133阳性和阴性肝癌细胞间micro-RNA的表达谱，发现了miR-130b是表达差异最大的micro-RNA。进一步研究发现miR-130b的表达与肝癌CSC呈正相关，miR-130b可以通过抑制TP53INP1蛋白的表达而增加细胞的自我更新能力，而自我更新能力是肿瘤干细胞的标志之一(Ma et al.，Cell Stem Cell 7：694-707，2010)。CSC是目前肿瘤研究的热点之一，因为CSC具有比其它肿瘤细胞对化疗药物更强的耐药性(Ma et al.，Oncogene 27：1749-1758，2008)。

发明内容

本发明提供了一种特异性抑制miR-130b基因表达的siRNA，其中，所述miR-130b的序列如SEQ ID NO：1所示，具体如下：cagugcaaugaugaaagggcau。

所述siRNA的序列如SEQ ID NO：2所示，具体如下：atgccctttcatcattgcactg，作用部位是互补结合区域。

本发明还提供了一种特异性针对miR-130b基因的表达载体，所述表达载体含有上述序列的siRNA。

上述序列的siRNA或/和上述的表达载体可应用在制备提高肝癌治疗效果的药物中。该药物以靶向抑制miR-130b基因的药物为有效成分。

本发明通过设计特异性抑制miR-130b基因表达的siRNA及载有miR-130b反义链核苷酸的表达载体，通过其与miR-130b特异性结合而阻断miR-130b的功能，进而阻断肝癌CSC的自我更新能力，提高其对化疗药物的敏感性。

下面将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1是异种移植的肝细胞癌(HCC)临床标本中细胞表面抗原标记(CD133)的表达与高肿瘤分期和不良预后有关的一系列实验结果图；

图1A是从NT组织或HCC组织标本中分解得到的单个细胞或其相应的在蜡包埋甲醛固定组织切片，对其进得CD133染色后的流式细胞结果图；

图1B是从NT组织或HCC组织标本中分解得到的单个细胞或其相应的在蜡包埋甲醛固定组织切片，对其进得CD133染色后的免疫组化结果图；

图1C是CD133的高表达与高复发率相关的分析图；

图1D是CD133的高表达与低完全生存率相关分析图；

图2是从HCC患者的临床标本中分离到的CD133⁺细胞的成瘤性和干细胞样特性一系列相关实验的结果图；

图2A是HCC临床标本中CD133⁺细胞的流式细胞点图；

图2B是肿瘤异种种植实验结果图；

图2C是CD133⁺TICs和CD133^-细胞连续第一代和第二代体外培养结果图；

图2D是CD133⁺细胞在不同的培养液中培养得到未分化和分化的球状肿瘤，分别将肿瘤溶解分离得到单个细胞的流式直方图分析结果图；

图2E是对未分化和分化的CD133⁺细胞的干细胞相关基因和多重耐药转运蛋白基因的表达进行qPCR分析的实验结果图；

图2F是对从新鲜切除的肿瘤标本中分离到的CD133⁺TICs和CD133^-细胞的qPCR分析结果图；

图3是从新鲜切除的HCC临床标本和未分化的球状肿瘤分离到的CD133⁺TICs中，miR-130b高水平表达一系列相关实验的结果图；

图3A是HCC标本(左，蓝色阴影，分析肿瘤数n＝5)和HCC细胞系PLC8024和Huh7(右，浅褐色阴影)miRNA的分析图；

图3B是对一组肝细胞系的CD133的表达(蓝色线条)和miR-130b的表达(红色线条)的分析图；

图3C是在15例HCC临床标本中，与CD133^-细胞相比，CD133⁺TICs中miR-130b的表达升高的qPCR检测后的散点分析图；