[发明专利]从乳化组合物中提纯核酸的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种核酸提纯方法及其应用，尤其是指一种从乳化组合物中提纯核酸的方法及其应用。

背景技术

核酸分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）两大类。小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）和微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长度在22nt左右、能调控基因表达的小分子RNA，能通过与靶基因的信使RNA（message RNA，mRNA）结合，阻断或抑制mRNA的转录，从而发挥转录后基因调控的功能。不仅广泛应用于生物医学研究，而且在治疗多种疾病如病毒感染、肿瘤、血管神经系统疾病等具有广阔的前景。近年来，在治疗皮肤相关疾病的研究中，用siRNA或miRNA抑制皮肤中某些基因的表达，获得了很好的治疗效果。

目前核酸提纯方法有主要分为两大类：一种是从生物材料中通过裂解破碎的方法提取纯化核酸，另一种为从复杂的组合物中分离纯化出核酸。

现有的从生物材料中提取核酸主要是用强变性试剂或生物酶破坏生物屏障，如细胞壁、细胞膜或细胞核膜，从而将DNA或RNA提取出来，然后再通过后期的纯化，最后得到纯的核酸。从组合物中分离纯化核酸，主要是通过物理的方法，如用硅胶吸附膜将核酸吸附在固相上，然后进行分离纯化。

P.D.Siebert和A.Chenchik等用异硫氰酸胍裂解细胞，然后在酸性条件下用苯酚除去共价的DNA，从而提纯出细胞中的RNA（Nucleic Acids Res., 21,2019-2020(1993)）。还有利用硫氰酸胍或类似的盐溶液来裂解细胞，还有通过溶菌酶等裂解细胞，然后通过乙醇沉淀的方法或是能吸附核酸的二氧化硅及类似物来纯化核酸（R.Boom等，J.Clin.Microbiol.,28,495-503（1990））。

用于核酸提取的酚：氯仿：异丙醇试剂，其体积比为为25：24：1，其中酚是强烈的蛋白质变性剂，能有效使蛋白质变性而除去。氯仿有强烈的脂溶性，去除脂类杂质。核酸易溶于水，不溶于有机溶剂。氯仿可以加速有机相与液相分层，去除核酸溶液中的过量酚（酚易溶于氯仿中）。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，核酸存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去核酸溶液中的酚。

在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙醇，所以一般用2倍体积乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高时，用异0.6倍的丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。异丙醇沉淀核酸时，高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中，从而可达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作，因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。异丙醇沉淀的效果要好一些，但最后大多用乙醇沉淀，因为乙醇容易挥发，对下游的实验影响小。用乙醇或异丙醇来沉淀核酸的机理是，核酸溶液是核酸以水合状态稳定存在，当加入乙醇或异丙醇时，乙醇或异丙醇会夺去核酸周围的水分子，使核酸失水而易于聚合。异丙醇比较疏水，能很更好地沉淀核酸，用乙醇的目的是去盐，它比异丙醇更亲水，所以能去掉一些盐离子。有时还用70%的乙醇洗样品也是为了增加盐的溶解度。

异丙醇的优点为所需容积小且速度快，适用于浓度低，而体积大的DNA样品的沉淀。0.54～1.0倍体积的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA；但对5sRNA、tRNA和多糖产物不产生沉淀，一般不需要在低温条件下长时间放置。缺点：易使盐类（如NaCl、蔗糖）与DNA共沉淀；在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去，所以常规需要用70％的乙醇漂洗DNA沉淀数次。乙醇是沉淀DNA的首选有机溶剂，对盐类沉淀少，DNA沉淀中所含的衡量乙醇易蒸发去处，不影响以后的实验。在适当的盐浓度下，2倍样品容积的95％乙醇可有效沉淀DNA，对于RNA则需要将乙醇量增加至2.5倍。缺点是总体积较大。需在-20℃放置较长时间，0.5～1h。要得到较纯的核酸，需要70%乙醇洗涤。

糖原用来作为沉淀辅助剂（Tracy,S.,Prep. Biochem.,11, 251-268 (1981)），在乙醇或异丙醇存在的情况下，可以与核酸共同沉淀下来，可以增加沉淀物的体积，能够帮助回收低浓度的核酸，并且糖原不会影响核酸的活性和吸光值。

醋酸钠溶液有促进核酸沉淀的作用，核酸带负电荷，加一定浓度的醋酸钠，使钠离子中和核酸分子上的负电荷，减少核酸分子之间的同性电荷排斥力，易于互相聚合而形成核酸钠盐沉淀。低pH值的醋酸钠溶液降低了反应混合物中的pH值，起到中和作用，从而使核酸复性，并核酸容易聚集。