[发明专利]一种高分子冷凝聚法制备萝卜几丁质结合蛋白的方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种高分子冷凝聚法制备萝卜几丁质结合蛋白的方法。

【背景技术】

萝卜几丁质结合蛋白(Raphanus sativus L Chitin-binding protin，缩写R·CBP，萝卜CBP)是一种能与几丁质特异结合的蛋白质，业已证明它具有杀菌作用(华南农业大学学报，1997，18(4)：72～75)：我们研究了该种蛋白质的抑菌谱较广，对白色葡萄球菌(Staphylococcus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草杆菌(Bacillus Subtilis(Ehrenberg)Cohn)等G⁺菌和变形杆菌(ProteusbacillusVulgaris)、大肠杆菌(Escherichia Cdi)、鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonellatyphimwium)、多杀巴斯德氏杆菌(Pastewella multaida)、鸡白痢沙门氏菌(Salmnella)、产气杆菌(Enterobacteratrogenes)等G^-菌以及酵母(SaccharomyceScerevisiae)，总状毛霉(Mucor racemosus)、里根霉、黑曲霉(Aspergillus niger)、青霉等真菌都有消杀效果。同时，它还对白菜软腐病菌(Frwinia carovorasubsp)、柑橘溃疡病菌(Citrus，Baterial lanker Disease)、番茄青枯病菌(RalstoniaSalanacearum)、稻瘟病菌(magnaporthe grisea)、水稻纹枯病菌(RhizoctoniasolaniAG-11A)、玉米小斑病菌(Drechslera maydis)、香蕉枯萎病菌(俗称香蕉癌症，Fusarium oxyporumsp.cubense)等植(作)物病原菌都有良好的杀菌作用。

这与目前市售溶菌酶完全不同，目前市售溶菌酶它们只对革兰氏阴性(G^-)菌起作用，而对革兰氏阳性(G⁺)菌、真菌都不起作用。

萝卜CBP的分子组成、结构和特性具有以下特点：

①是一种单成分单体酶，而且是一种诱导酶；

②是一种相对分子质量较小(11.4KD左右)的碱性蛋白质；

③是一种既具有溶酶活力，又具有几丁质酶的双功能酶蛋白；

④其双功能酶活力在0-60℃，pH2.4-10.0范围内活力稳定，在室温下两年内活力基本稳定；

⑤在一定条件下，其酶蛋白结晶为长方形。活性中心包括有Glu、Asp、His和Trp残基。这与动、微生物的酶不同，它多了一个His和Trp残基；也与其它植物溶菌酶不同，它有一个Trp和His残基，却没有Cys残基，故抑菌效果不同；

⑥它还与其它溶菌酶和几丁质酶不同，它不是糖蛋白，不含任何链内和链间二硫键，所以酶活性稳定，抑菌效果明显；

⑦其N-端氨基酸残基顺序为WDADMVAKUM，对此序列进行Blastp搜集，结果发现，在现有数据库中没有任何与其相匹配的有关信息。肽质量指纹图谱分析鉴定，结果发现，在现有蛋白质数据库中也没有任何与其相匹配的有关信息。从而证明它是一种新发现的既具溶菌酶又具几丁质酶活性的几丁质结合蛋白。

依据其分子组成、性质及其结构特征，以及杀菌效果，尤其对G^-菌，特别是对真菌灭菌效果更为强烈，该萝卜CBP具有广泛的应用价值和良好的市场前景和潜力。在医药上，抗真菌药极少，抗生素由于微生物的抗药性和对机体的毒副作用，限制了其应用；在农业上，农作物病害90％以上是真菌引起的，由于农药的残留和对环境的污染，也限制了应用，同样在食品、日化、禽畜养殖的防病抗病等行业，萝卜CBP用途极广，有待开发利用。

萝卜在我国各地均能种植，尤在岭南等地一年四季均可抪种，萝卜几丁质结合蛋白的生产制备原料广泛、价廉，但酶含量低，现有制备工艺较复杂，难以实现工业化。

聚丙烯胶(polycrylic Acid，PAA)是以游离单体丙烯酸聚合而成的高分子化合物：

随其聚合度不同相对分子质量而异。PAA无毒、易溶于水，为多聚电介质。在工业上常用作分散剂。

【发明内容】

本发明的目的是提供一种高分子冷凝聚法制备萝卜几丁质结合蛋白的方法，工艺较简单，易于实现工业化，能较低成本且无环境污染。

上述目的通过以下技术方案实现：