[发明专利]一种香蕉穿孔线虫特异性LAMP检测方法及其应用

权利要求书

1.一种香蕉穿孔线虫特异性LAMP检测方法，其特征在于：其中的LAMP反应体系中所使用的引物分别是：

RSF3：5’-AGCTGGCGTATCTAGCCTG-3’，

RSB3：5’-AACGCCAGAACGCACAAC-3’，

RSFIP：5’-GCACCCAACGGACAAAACAACA-CATTCAGCCTCTGGGCATC-3’，

RSBIP：5’-GCAGCGCTGTGAGCCTGTTT-GTTCGCCCATTCTGGGTAC-3’，

RSLF：5’-AGGCGTCGTCCCAAGGTCA-3’。

2.根据权利要求1所述的检测方法，所述LAMP反应体系包括：引物混合液、反应混合液和1μL DNA模板，用灭菌双蒸馏水补全到25μL，所述引物混合液为外侧引物RSF3和RSB3各0.2μM，内侧引物RSFIP和RSBIP各1.6μM，环引物RSLF为0.4μM；所述反应混合液为20mM Tris-HCl，10mM(NH₄)₂SO₄，10mM KCl，8mM MgSO₄，0.1％Triton X-100，0.8MBetaine，1.4mM dNTPs，8U Bst DNA聚合酶大片段。

3.根据权利要求2所述的检测方法，所述LAMP反应的条件为在61-65℃温育30-90min，82℃保温5-10min。

4.根据权利要求3所述的检测方法，所述LAMP反应的最终扩增产物中加入有显色剂，所述显色剂为SYBR green I与PCR级DMSO混合液，其体积比为1∶9。

5.根据权利要求1所述的检测方法，所述DNA模板为从罹病香蕉穿孔线虫病的植物组织中提取。

6.根据权利要求5所述的检测方法，所述提取的方法为：截取0.2-0.5cm长的罹病植物组织放入装有48μL的LA缓冲液的离心管中，加入2μL的LB提取液，混合均匀后离心，放入液氮中速冻，用研磨棒将其捣碎，点动离心后将离心管放入65℃条件下温育45min，95℃下反应10min，冷却至室温，点动离心后的上清液即可作为线虫DNA模板，所述LA提取液为100mM NaCl，pH 8.5的100mM Tris-HCl，pH 7.4的50mM EDTA，1％SDS和1％巯基乙醇组成，LB提取液为20mg/mL蛋白酶K。

7.一种香蕉穿孔线虫特异性LAMP检测试剂盒，包括：

1)引物混合液：外侧引物RSF3和RSB3各0.2μM，内侧引物RSFIP和RSBIP各1.6μM，环引物RSLF为0.4μM，

2)反应混合液：20mM Tris-HCl，10mM(NH₄)₂SO₄，10mM KCl，8mM MgSO₄，0.1％Triton X-100，0.8M Betaine，1.4mM dNTPs，8U Bst DNA聚合酶大片段。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，还包括显色剂，所述显色剂为SYBR green I与PCR级DMSO混合液，体积比为1∶9。

9.根据权利要求7所述的试剂盒，还包括从罹病植物组织中香蕉穿孔线虫DNA提取试剂，由LA提取液和LB提取液组成，所述LA提取液由100mM NaCl，pH 8.5的100mMTris-HCl，pH 7.4的50mM EDTA，1％SDS和单独分装的占总体积比为1％巯基乙醇组成，LB提取液为20mg/mL蛋白酶K。

10.权利要求1-6任一香蕉穿孔线虫特异性LAMP分子检测方法或权利要求7-9任一试剂盒在诊断植物、土壤中的香蕉穿孔线虫感染情况或鉴别香蕉穿孔线虫中的应用。