[发明专利]细菌表面抗原Ag43表达系统的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种可以和细菌表面抗原Ag43嵌合表达的原核表达系统的构建方法。

背景技术

免疫耐受是一个自然现象，免疫系统对自身抗原分子(比如肿瘤抗原、过敏性疾病发病相关的自身分子治疗靶点)具有先天的免疫耐受能力，如何诱导免疫系统打破这种免疫耐受是当今科学研究的重大问题。

研究表明，antigen 43(Ag43)是大肠埃希氏菌(大肠杆菌)表达的一种表面抗原蛋白分子，在一个大肠埃希氏菌表面，可表达5万多个Ag43分子。和细菌表面表达的其它蛋白(如菌毛或鞭毛)不同，Ag43不需伴侣分子和/或引导分子，本身就可抵达细菌表面。它由信号肽和α和β二个结构域三个部分组成。信号肽引导α和β二个结构域通过细菌内膜，然后β结构域在细菌外膜形成一个环形通道，保证α结构域到达细菌外膜表面(图1)。目前，已有人将此蛋白开发成一个用于细菌表面展示的表达载体，还发现Ag43不但能在缺失了Ag43基因(又称flu基因)的大肠埃希氏菌的表面表达，还可以表达于其它多种细菌表面，如绿脓杆菌、肺炎克雷白菌等。另外，Ag43和细菌菌毛表达载体不同，插入高达500个氨基酸的外源蛋白后也可表达于细菌表面(菌毛载体只能插入20～30个外源氨基酸)。目前研究证实Ag43具有十分强大的免疫原性，含有多种T和B淋巴细胞表位，如果将外源抗原基因在Ag43α结构域的148个氨基酸处插入，构成Ag43的嵌合分子，能促使免疫系统产生对嵌合的外源基因蛋白的免疫反应，产生外源蛋白特异的抗体。此外，Ag43只需要加热就可以从细菌体分离，纯化技术也不复杂，因此，Ag43是重组外源嵌合蛋白最理想的展示载体。在疫苗制备方面展现出了良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种可以和细菌表面抗原Ag43嵌合表达的原核表达系统的构建方法。来源于大肠杆菌JM109的Ag43基因敲除细菌Tan109和重组质粒pET-Ag43作为一个有效的原核基因表达系统，可以将外源基因嵌合于Ag43的中进行共表达，并能将外源基因和Ag43嵌合表达(展示)于细菌表面，通过加热就可获得和Ag43嵌合的重组蛋白，比传统的提取重组蛋白方法容易，活性好。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种细菌表面抗原Ag43表达系统的构建方法，包括以下步骤：

(1)、利用基因敲除技术将大肠杆菌JM109的Ag43基因敲除，获得了Ag43基因敲除细菌Tan109；

(2)、利用基因工程技术将Ag43基因第598bp以后的基因插入原核表达质粒pET-28a多克隆位点Hind III和Xho I之间，获得重组质粒pET-Ag43，保留pET-28a多克隆位点Xho I之前所有的酶切位点；此后，将可以发出绿色荧光的FGP基因插入重组质粒pET-Ag43多克隆位点Nhe I和Hind III之间，获得了重组质粒pET-Ag43-FGP；

(3)、重组质粒pET-Ag43-FGP可以在细菌Tan109中有效表达，并将重组嵌合蛋白Ag43-FGP表达于细菌表面；

(4)、在细菌表面表达的重组嵌合蛋白Ag43-FGP可以通过加热法从细菌表面分离获取；

(5)、所获得的Ag43基因敲除细菌Tan109和构建的重组质粒pET-Ag43二者构成了一个基因工程原核表达系统；由于重组质粒pET-Ag43具有多个克隆位点，可以任意将外源基因取代本发明的FGP位置克隆进入该重组质粒pET-Ag43，(类似于本发明的重组质粒pET-Ag43-FGP)，并能在细菌Tan109中有效表达，通过加热就可获得相应的Ag43嵌合重组蛋白。

本发明与现有技术相比较：

(1)、细菌Tan109和重组质粒pET-Ag43可以作为一个有效的基因表达系统，可以将外源基因(本发明用绿色荧光FGP基因作模式外源基因)嵌合于细菌本身基因Ag43中进行嵌合表达，并能将嵌合表达的嵌合重组蛋白展示于细菌表面，通过加热就可获得嵌合重组蛋白，比传统的提取重组蛋白方法容易，活性也会更好。

(2)、所构建的重组质粒pET-Ag43具有多个克隆位点，可以任意将外源基因(取代本发明的FGP位置)克隆进入该重组质粒，获得相应的Ag43嵌合重组蛋白。

(3)、由于Ag43是细菌的抗原分子，在各种动物或人体中均可诱导免疫反应，因此，利用本发明所诱导的表达的外源基因和Ag43的嵌合蛋白可能是一种有效的疫苗模式，用来打破表达的外源基因蛋白抗原的免疫耐受，增强外源基因蛋白的免疫原性。在基因工程、重组疫苗和免疫耐机理研究方面具有良好的应用前景。