[发明专利]一种农杆菌介导的胚性愈伤转化培育石竹转基因植株的方法

说明书

技术领域

本发明属于观赏植物组织培养和遗传转化技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的胚性愈伤转化培育石竹转基因植株的方法。

背景技术

石竹属植物共有17种1亚种9变种，多为花卉产业、园林绿化及城市美化中的重要材料。其中石竹为多年生植物，常作一二年生栽培。国内外有关石竹的遗传转化是以叶片和幼嫩植株为受体，以幼嫩植株为受体，切去植株顶部即在顶芽部形成伤口，用微注射器吸取根癌农杆菌悬浮液注射在伤口上，该方法所取材料幼嫩，容易在转化感染过程中死去。而以叶片为受体再生率较低，且石竹叶片较小，农杆菌侵染前对叶片的处理较难，特别是将叶片划伤以利于菌液的侵染，划伤程度不易掌握，另外，农杆菌侵染时间不易控制，时间稍长则叶片易受伤害，时间过短则转化不易成功，即阳性植株不易获得。

胚性愈伤转化简单，并可大量繁殖以供转化使用，是一种理想的转化受体。有关石竹转化的研究报道较多，但是，以胚性愈伤为受体进行遗传转化获得转基因植株的研究还未见报道。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术缺陷，针对遗传转化中的石竹受体材料难以成活、转化率低、侵染后的再生率低、侵染时间不易把握等，提供一种更加高效、简便的遗传转化获得转基因植株的方法。

本发明的技术方案如下所述。

一种农杆菌转化石竹胚性愈伤的方法，其步骤包括胚性愈伤诱导、遗传转化和植株鉴定，本发明的要点是，采用石竹花瓣或花丝为材料诱导胚性愈伤，采用诱导出的胚性愈伤作为遗传转化受体材料，经农杆菌侵染、共培养、选择培养、分化培养和生根培养，将GUS报告基因或ACO目的基因导入石竹胚性愈伤，利用卡那霉素或潮霉素对转化后的胚性愈伤进行筛选，通过GUS染色和PCR检测筛选得到转基因胚性愈伤和转基因植株；

其步骤如下：

1)将长度为7.0-8.5cm的石竹花蕾，放入垫有湿润滤纸的培养皿内，置于4℃冰箱中冷藏处理4-6d；

2)胚性愈伤诱导：将步骤1)冷藏处理后的花蕾，灭菌后置于超净工作台上剥出花瓣及花丝，接种于胚性愈伤诱导培养基上，诱导胚性愈伤；

3)侵染：将步骤2)诱导获得的胚性愈伤置于农杆菌菌液中进行侵染13-15min，期间每2-3分钟摇动一次；

4)共培养：将步骤3)中胚性愈伤从农杆菌液中取出，用无菌滤纸吸干，接入共培养培养基中；在26±1℃黑暗条件下培养4d；

5)选择培养：将步骤4)中共培养后的胚性愈伤转入选择培养基上，筛选3次，每月更换一次新鲜选择培养基，得到抗性胚性愈伤；

6)抗性芽分化及生根：将步骤5)得到的抗性胚性愈伤转移至分化培养基上诱导，得到抗性芽；将该抗性芽切下转移至生根培养基上使其生根，得到再生植株；

7)对步骤6)所得的转GUS基因或ACO目的基因胚性愈伤和植株进行GUS化学染色和PCR检测，验证获得的转基因胚性愈伤和转基因植株；

培养基组分及配比如下：

胚性愈伤诱导培养基：MS，附加2，4-D 2.0mg/L，6-苄基氨基嘌呤1.0mg/L，蔗糖30g/L和琼脂7.0g/L；用蒸馏水定容至1L；pH5.8；

胚性愈伤继代培养基：MS，附加蔗糖60g/L和琼脂7.0g/L；用蒸馏水定容至1L；pH5.8；

共培培养基：MS，附加6-苄基氨基嘌呤2.0mg/L，萘乙酸0.1mg/L；蔗糖60g/L；琼脂7.0g/L；乙酰丁香酮1000umol/L；用蒸馏水定容至1L；pH5.8；

选择培养基-1：MS，附加6-苄基氨基嘌呤2.0mg/L；萘乙酸0.1mg/L；蔗糖60g/L；琼脂7.0g/L；卡那霉素50mg/L；头孢霉素400mg/L；用蒸馏水定容至1L；pH5.8；

选择培养基-2：MS，附加6-苄基氨基嘌呤2.0mg/L；萘乙酸0.1mg/L；蔗糖60g/L；琼脂7.0g/L；潮霉素5mg/L；头孢霉素400mg/L；用蒸馏水定容至1L；pH5.8；

分化培养基：MS，附加6-苄基氨基嘌呤2.0mg/L；萘乙酸0.1mg/L；蔗糖60g/L；琼脂7.0g/L；用蒸馏水定容至1L；pH5.8；

生根培养基：MS，附加活性炭0.2g/L，蔗糖60g/L和琼脂9.0g/L；用蒸馏水定容至1L。

其中：

步骤5)所述的选择培养还包括：转GUS报告基因时所用的培养基为选择培养基-1；转ACO目的基因时所用的培养基为选择培养基-2。

更详细的技术方案如《具体实施方式》。