[发明专利]用于扩增H5N1流感病毒NP基因核苷酸片段的引物及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及医学技术领域，特别涉及用于扩增H5N1流感病毒NP基因核苷酸片段的引物。

背景技术

流行性流感(简称流感)是由流感病毒引起的一种烈性传染病，对人类与畜禽危害严重，不仅会给养殖业带来打击，对国民经济乃至整个世界经济都会产生影响，而且危害人类健康。流感病毒有甲、乙、丙三个型，其中甲型所引起的流感流行最为广泛和严重。流感病毒颗粒由三层组成，最外层是两种突起的表面抗原，即血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，中间层由一层类脂体和一层膜蛋白(MP)构成，核心层是RNA基因及与之结合的蛋白质即核蛋白(NP)，其中，血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)是甲型流感病毒亚型划分的主要依据。禽流感病毒是甲型流感的一种，H5N1是禽流感病毒的一种亚型，具有高致病性，为卫生部新传染病防治法中规定报告的法定传染病，又称人感染高致病性禽流感。H5N1主要影响禽类如鸡、鸭等和多种哺乳动物如小鼠、雪貂、豚鼠、田鼠、猴子等。由于雪貂与人的呼吸道上皮类似，且感染后的症状与人相近，因此雪貂是最理想的动物模型。此外，猴子作为高级灵长类动物，其天然免疫和适应性免疫更接近于人类，因此在流感的药物和疫苗研究中，猴子作为动物模型也有不可替代的作用。

流感病毒变异极为频繁，常造成免疫失败，给防控带来困难。因此，早期快速诊断和血清学监测对防控流感具有重要意义。流感病毒在动物体内的毒力评价和检测主要通过两种方法：病毒分离和病毒的定量PCR检测。其中病毒分离出活病毒是组织感染的最有力的证据，但是该方法只能检测活病毒，对于流感这种急性病毒易漏检；此外，该方法需要在国家认可的生物安全三级实验室进行，且实验操作繁琐、耗时、灵敏度不高，不能满足疫情或疾病早期快速诊断和现场诊断。病毒的定量PCR弥补了病毒分离检测方法的不足，可以快速、特异性地检测样本中痕量病毒，且操作在生物安全二级实验室即可，容易满足安全性要求。流感病毒的定量检测方法有两种，一种是Taqman探针法，该方法特异性好，但探针较昂贵，引物和探针的要求很高，对于大量样品的检测费用过高；另一种是常见的SYBR Green定量PCR，技术成本较前者低，灵敏度高，特异性虽不如探针法，但能够满足流感病毒的检测要求。世界卫生组织(World Health Organization，WHO)推荐了用探针法和染料法检测H5N1时适用的引物，该引物对病人和实验动物的鼻咽拭子、肛拭子的病毒载量检测效果勿容置疑，但是用染料法检测雪貂和猴子组织中H5N1时，有非特异性扩增，不适于雪貂和猴子组织中的病毒定量检测。因此，提供能够特异性检测H5N1流感病毒的引物组及方法具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供用于扩增H5N1流感病毒NP基因核苷酸片段的引物组。该引物组由具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的下游引物组成，能够排除背景基因组的非特异性干扰，特异性扩增H5N1流感病毒中NP蛋白的第1125至第1423位长度为199bp的核苷酸片段。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了用于扩增H5N1流感病毒NP基因核苷酸片段的引物组，由具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的下游引物组成。所述NP基因的Genebank登录号为133711835，本发明提供的引物组特异性扩增NP基因的第1125至第1423位长度为199bp的核苷酸片段。

流感病毒颗粒由三层组成，最外层是两种突起的表面抗原，即血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，中间层由一层类脂体和一层膜蛋白(M)构成，核心层是RNA基因及与之结合的蛋白质即核蛋白(NP)。其中，HA和NA是甲型流感病毒亚型划分的主要依据，HA抗体能中和病毒和抑制血凝素，是最主要的保护性抗体，NA抗体能限制病毒的释放和扩散，也有保护作用。M和NP是决定流感病毒型别的型特异性抗原，抗原性较稳定，其抗体无保护作用。尽管流感病毒极易发生变异，但主要集中在血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)上，NP蛋白却高度保守，Shu L L等对从1933年-1990年间分离的人流感病毒NP基因演化变异情况进行研究发现，NP基因变异率为每年2.3×10^-3，其中只有32％的碱基突变导致了氨基酸变化，其余均为无意义突变。NP蛋白的这一特点使其成为流感病毒诊断用的理想靶蛋白。因此，以NP为靶基因，提供适于扩增H5N1流感病毒中NP基因核苷酸片段的引物组具有现实意义。