[发明专利]棉蚜的特异性快速PCR检测方法及所用的SCAR引物和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种棉蚜的特异性快速PCR检测方法及所用的SCAR引物和试剂盒，属于分子生物学领域。

背景技术

棉蚜Aphis gossypii Glover即瓜蚜，俗称腻虫、蜜虫、油虫，属同翅目，蚜科，蚜属，是一种世界性害虫，除西藏外，在全国各地都有发生，其中以黄河流域、辽河流域和西北棉区受害较重。棉蚜为多食性害虫，寄主范围广泛，全世界已知寄主植物74科285种，我国已记载113种，其中越冬寄主(亦称第一寄主或原生寄主)是棉蚜于秋末冬初产卵越冬、翌春孵化后生活一段时间的植物，包括木槿、花椒、石榴、鼠李属、车前草、夏至草、紫花地丁、苦荬菜等；侨居寄主(亦称第二寄主、次生寄主或夏季寄主)是棉蚜春夏秋季生活的植物，主要有棉花、瓜类、黄麻、红麻、菊科、茄科、苋科等。在瓜类作物上，棉蚜以成蚜和若蚜群集在幼嫩叶片背面以及嫩尖和嫩茎处吸食汁液，受害叶片卷缩，瓜苗生长停滞，严重时蚜虫密密层层，导致瓜苗死亡；瓜的成熟叶片受害后，叶片大部或全部褐变，干枯死亡，结瓜期缩短，瓜果品质下降。在棉田，棉蚜常群集于棉花嫩茎、嫩叶背面刺吸汁液，使受害棉株呈“龙头”状、棉叶畸形卷缩等；在苗期危害，可导致棉苗生长停滞，植株矮小，果枝和棉蕾形成延晚，造成晚熟减产；在蕾铃期危害，可导致落叶、落蕾和落铃而严重减产。同时，棉蚜大量分泌蜜露诱发霉菌滋生，阻碍叶片正常的光合作用和生理作用。而更为重要的是，棉蚜还能传带黄瓜花叶病和大豆花叶病等50多种植物病毒，常造成病毒病大流行，使棉花或瓜类作物幼叶卷缩、发育延迟，造成严重减产。

棉蚜发生范围广泛，种群数量庞大，危害期较长，因此其危害所造成的损失始终位居全国首位；加之棉蚜已对多种常用化学药剂产生了较高的抗性和交互抗性，目前已成为我国华北以及西北半干旱地区一种毁灭性害虫。如1985年吐鲁番地区棉蚜暴发成灾，继而在新疆各棉区普遍发生，并严重危害；1994年新疆棉区约13万公顷棉田发生棉蚜危害，产量损失达30％以上；1995年新疆南疆棉区棉蚜大发生，发生面积达40万公顷；2004年棉蚜在麦盖提县暴发，导致部分乡村的棉田毁种，损失惨重。与此同时，棉蚜对各种杀虫剂的抗药性也在持续攀升，如1963年棉蚜对内吸磷和对硫磷的抗性已达410.7和23.6倍；上世纪80年代初期随着拟除虫菊酯类等农药的大量使用其抗药性急剧上升，至1995年对溴氰菊酯的抗性已达1.7万倍的超高抗性水平，对氨基甲酸醋类杀虫剂灭多威的抗性已达90倍以上；近年来，新烟碱类杀虫剂广泛用于防治棉蚜，而2005年的监测显示，棉蚜对啶虫脒和吡虫啉的抗性指数也已达到了25.8和55.0的中等和高等抗性水平。显然，蚜虫种类的准确识别是棉蚜有效防治、防止其它种类蚜虫抗药性产生的首要条件。

棉蚜体型微小，成虫体长约1.1-1.9mm，卵长约0.5mm；具有干母、无翅胎生雌蚜、有翅胎生雌蚜、无翅有性雌蚜和有翅雄蚜等不同的型，卵、若蚜和成蚜等不同的虫态，以及随季节或型的变化有黄色、黄绿色、深绿色、棕色、蓝黑色、灰褐色、墨绿色、暗红色、蓝灰色、淡红色、灰黄色等不同的体色，并且具有越冬寄主和侨居寄主。我国有记录的蚜虫种类有1000余种，因此加强棉蚜的可持续治理必须建立一套快速而准确的分子检测方法。目前国际上用于棉蚜鉴定的方法主要有：1)形态特征鉴定；2)PCR技术等。但目前国内针对棉蚜尚没有标准的检测方法。

RAPD技术和SSR技术曾用于鉴别棉蚜及其近缘种。RAPD技术是以不同的基因组DNA为模板，以单一的随机寡聚核苷酸(通常10个碱基)为引物，通过PCR反应，产生不连续的DNA产物(通常可检测到5～9条条带)。通常，不同基因组的DNA序列存在差异，而且随着不同区段上可与引物同源互补的位点的不同，其扩增产物的数量、大小亦不相同，因而表现出多态性。SSR技术又称微卫星DNA(micro-satellite DNA)或短串联重复(short tandem repeat)，是由几个核苷酸(2～5个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列，分布于整个基因组的不同位置上，由于重复次数的不同及重复程度的不完全形成每个位点的多态性，并据此判断检测结果。SCAR-PCR技术检测是在RAPD技术的基础上发展起来的特异序列扩增区域标记，是利用特异性的引物，根据预期DNA条带的有无来判断检测结果，无需测序和序列比对，具有灵敏度高、特异性强、快速、简便且重现性和稳定性强等优点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种棉蚜的特异性快速PCR检测方法及所用的SCAR引物和试剂盒，本发明方法检测准确性高，操作简便快捷，特异性强。