[发明专利]3-甾酮-△1-脱氢酶和工程菌及应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，更具体地，涉及一种3-甾酮-Δ1-脱氢酶和工程菌及应用。

背景技术

许多真菌，例如Aspergillus sp.、Metarhizium sp.、Fusarium sp.、Neurospora sp.、Neosartorya sp.等，可产生甾型抗生素。甾体型抗生素包括烟曲霉酸、夫西地酸及相关类似物，其中，结构式I分别显示了环戊烷多氢菲(Cyclopentanoperhydrophen antrene)、胆固醇(Cholesterol)、烟曲霉酸(Helvolic acid)与夫西地酸(Fusidic acid)的结构。这些甾型抗生素对细菌具有较好的抑制作用，例如夫西地酸在临床上已应用三十多年；但是，对于一些真菌而已，甾型抗生素又会是一种重要致病性毒力因子，例如烟曲霉酸是金龟子绿僵菌杀昆虫的一种毒力因子。

式I

目前工业上制备甾体药物雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(androsta-1，4-diene-3，17-dione，简称ADD)主要途径是分支杆菌以植物甾醇为原料转化生产雄甾-4-烯-3，17- 二酮(AD)/ADD混合液，再从中分离雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)，但利用植物甾醇等为底物进行微生物转化的一个显著问题是生物转化的最终产物典型地含有显著的AD和ADD。由于AD和ADD具有相似的化学结构，将这两种甾类化合物进行相互分离是困难和昂贵的。

由于3-甾酮-1-脱氢酶(KSDD)可催化3-酮基甾体化合物的C1，2位脱氢反应，该反应如图1所示。因此，另一种途径是构建表达3-甾酮-1-脱氢酶基因(ksdD)的工程菌，但由于细菌来源的ksdD基因均表达膜蛋白，极大地了该蛋白在工业上的应用。

因此，有必要对此加以改进，以解决AD、ADD难以分离的工业难题，从而打破工业生产ADD的瓶颈。

发明内容

在对烟曲霉的研究过程中，本申请的发明人从金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopise)中寻找到烟曲霉酸基因簇，并成功克隆到3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因，经测序比对发现来源于金龟子绿僵菌的烟曲霉酸基因未经报道，为一新发现的基因。因此，本发明的目的之一在于提供一种3-甾酮-Δ1-脱氢酶及其基因；目的之二是提供包括该3-甾酮-Δ1-脱氢酶的表达载体和利用该载体转化的重组微生物，如基因工程菌株；目的之三是提供该3-甾酮-Δ1-脱氢酶的基因工程菌株的应用。

本发明的3-甾酮-Δ1-脱氢酶得自金龟子绿僵菌。本发明采用的技术方案是：构建金龟子绿僵菌基因文库，并从文库中钓取3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因(如SEQ ID NO：1所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)。当然，如本领域的技术人员所知，本发明的3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因还可以是编码由序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的其他核苷酸序列；而本发明的3-甾酮-Δ1-脱氢酶不仅限是具有序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，还可以是将SEQ ID NO：2中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有相同酶活性的由序列2衍生的蛋白质，比如在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸，如与载体编码的氨基酸融合、不影响序列的修饰形式上的差异等情况。

本发明提供的包括3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因的核苷酸序列的表达载体是用常规方法将本发明的3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成，该载体可以是市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，如pUC，pBluescript(Stratagene)，pET(Novagen，Inc.，Madison，Wis)，PQE(Qiagen)，pREP，pSE420和pLEX(Invitrogen)，但不限于这些载体。

较佳的是将PCR扩增到的3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因产物和表达载体pPIC3.5K连接得到重组质粒。

本发明提供的转化体，其是将包含本发明的3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因核苷酸序列的表达载体转化到宿主微生物，如感受态毕赤酵母KM71或GS115中得到基因工程菌。

其中，该宿主细胞可以为原核、真核微生物或昆虫等。较佳的是毕赤酵母，得到相应的转化体为上述的基因工程菌株。

本发明提供的3-甾酮-Δ1-脱氢酶重组菌株可用于转化3-酮基甾体化合物，优选的还可用于将雄甾-4-烯-3，17-二酮转化为宝丹酮的应用。