[发明专利]纳米材料固载蛋白酶分子的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物纳米制剂与生物纳米酶催化领域，更具体地讲，本发明涉及纳米材料固载蛋白酶分子的方法及其应用。

背景技术

对于蛋白质稳定性研究，早在二十世纪九十年代中期，人们就开始对蛋白质稳定性进行了系统的研究。目前，国内外对蛋白质稳定性的改进主要是对其进行修饰和在溶液中添加各种稳定剂，前者由于成本较高主要用于修饰药用蛋白，例如聚乙二醇(PEG)修饰各种细胞因子等蛋白类药物，而后者主要用于各种酶制剂。通过稳定剂来稳定蛋白质比对其进行化学修饰简单易行，成本也较低；并且蛋白质在经过修饰后，结构、活性和抗原性都发生了改变，但是，这种改变往往对蛋白质的实际利用是不利的，所以国内外研究尝试添加稳定剂的方法来实现蛋白酶的稳定性。

蛋白酶的不稳定性是一直存在的一个问题，它严重制约着酶的实际应用。由于蛋白酶是一种具有复杂的空间立体结构的大分子物质，易受外界条件的影响变性，同时每一种蛋白酶都有自己特有的空间结构或三维结构，所以很难找到一种稳定性剂适合所有的蛋白质。这导致研制适合长期保存蛋白质制剂的配方并非易事。这主要是由于蛋白酶的物理和化学不稳定性决定的，与低分子量的化合物不同，要想保持蛋白酶的活性就必须保持其三维结构不变，另外，组成蛋白质骨架的氨基酸残基很容易发生化学降解，因此从分子水平来认识蛋白酶的不稳定性，解决众多蛋白酶制剂的稳定问题具有深远的现实意义。蛋白酶的不稳定性主要是因为其聚集作用，而蛋白酶的聚集主要是因为其构象的改变，蛋白质构象变化随着溶剂极性的减小而增大。由于蛋白质同时含有亲水性和疏水性基团，疏水部分容易发生延伸变性，所以蛋白质疏水位点越多，越易发生聚集。蛋白质聚集传统的观点认为是跟蛋白质的伸展模式有关，但是根据最新的研究，认为蛋白质聚集是与折叠和伸展之间的一种中间模式有关。全部折叠或全部打开的蛋白质不易聚集，因为它们疏水端的链要么完全包裹不与水接触要么随意的暴露，而中间态的蛋白质为了掩饰邻近的疏水基团导致了聚集的发生。另有文献报导，蛋白质聚集基本上都是由β折叠产生的，而α螺旋对聚集的影响不大，这可能是由于α螺旋的偶极距比β折叠的强。蛋白质的降解途径可分为两种类型，即化学不稳定性和物理不稳定性．化学不稳定性是由于氨基酸的残基的修饰／变化，主要有几种反应：氧化作用、还原作用、脱氨基反应、水解作用、精氨酸转化、β消除和消旋作用．物理不稳定性涉及蛋白质的二级、三级、四级结构的变化，不涉及蛋白质共价键的变异，包括变性、表面吸附、凝聚和沉淀。另外有关研究表面，蛋白质二级结构控制蛋白质的聚集、稳定性及毒性。

 游离酶对工业催化过程存在一定的障碍。酶催化过程已经在工业中获得了较多的应用，但仍然存在以下障碍，限制了酶在工业上更广泛的应用：(1)酶在细胞外由于脱离了细胞内的环境，往往很难保持长期的稳定性，容易失去活性，尤其在油相或油-水界面，更容易失去活性；(2)反应速率较化学反应慢；(3)由于酶需要提取和纯化，同时重复利用率低、成本高，涉及辅酶体系时成本进一步增高；(4)现有的工业应用大多局限于单酶催化体系，多酶体系应用困难，限制了更多高附加值产品的开发。自然界中的酶至少有70万种，目前只有1万种的结构和化学性能已知，而实现工业应用的仅上百种。因此，在开发利用酶资源方面，可以说才刚刚起步，潜力巨大，迫切需要克服影响酶工业化应用的障碍，实现酶的高效利用。这不仅需要使单个酶在各个体系(水相、油相、油-水界面等)发挥其最高活性，而且需要实现酶的重复利用、实现多酶的协调反应和辅酶再生。近年来，随着纳米科学和纳米技术的迅速发展，有望利用纳米技术实现上述关键技术的突破。

 传统酶固定化还存在着一定的缺陷性。酶的固定化是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，使之仍能进行其特有的催化反应，并可回收及重复使用的一类技术。按其性质分，主要有四种，即包埋法、交联法、吸附法及共价法，与游离酶相比，固定化酶在保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性的同时，还呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续及可控、工艺简便等一系列优点。酶的催化效率及选择性在很大程度上取决于所使用酶的比表面积和几何形状；如不考虑其它因素，则粒径越小，比表面积越大，催化剂的效率就越高。传统的固定化酶粒径一般为(0.1-10)mm。由于受到固定酶量少和较大传质阻力的影响，这类固定化酶的催化效率比较有限。而纳米级固定化的酶具有比表面积大、传质阻力小、固定酶量多和催化效率高等优点，这使得酶的纳米级固定化技术受到越来越广泛的关注。