[发明专利]沙门氏菌微量MPN检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用微量培养基培养和鉴别沙门氏菌，并根据MPN方法进行样品中沙门氏菌快速定量检测，属微生物培养与检测领域。

背景技术

1885年沙门氏等在霍乱流行时分离到猪霍乱沙门氏菌，故定名为沙门氏菌属，沙门氏菌属肠道细菌科，包括那些引起食物中毒，导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌，它们有的专对人类致病，有的只对动物致病，也有对人和动物都致病。沙门氏菌病则是指由各种类型沙门氏菌所引起的对人类、家畜以及野生禽兽不同形式的总称，它是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一，人畜感染后可呈无症状带菌状态，也可表现为有临床症状的致死疾，它可能加重病态或死亡率，或者降低动物的繁殖生产力。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。我国内陆地区也以沙门氏菌为首位。

自19世纪后期，沙门氏菌首次被鉴定为人类的一种病原以来，检测方法学都是建立在采取感染病人的粪便或血液作为临床病料的基础上。此后的60年间，用于从食品中分离沙门氏菌的方法实质上与那些用于临床病料的方法是相同的。但至少有三个因素限制了用于临床病料的方法应用在食品分析上。第一，通常，沙门氏菌的含量水平在污染食品中比有感染病人的病料中要低很多；第二，食品本身的性质会干扰病原的检测，例如，某些食品中固有菌群可能处在一个很高的水平，从而影响特定细菌的选择性分离和鉴定；第三，与临床病料不同的是，经过加工的食品，由于加热、干燥、高含盐量、酸和冷冻等因素的作用，其中的沙门氏菌受到了尚不致命的损伤或称“致伤”。这就形成了一个具有不同生长特性的细菌群。这种现象对那些希望从食物样品中分离出沙门氏菌的食品分析家来说有很大影响，因为在选择培养基上直接培养“致伤”的沙门氏菌通常是以细菌死亡和试验失败而告终。为克服这些困难，人们建立了一种简单的微生物增殖步骤，专门针对以食品为传播载体的病原。虽然这些方法本身证明是可靠的，但却很费力、耗时，需要3～5天才能完成。

用于沙门氏菌分析的传统方法是食物样品分步增菌，以增加病原的可检出率，这种培养方法总体可分4个不同阶段或步骤。第一步(预增菌)，将样品加到一种高营养、无选择性的培养基中，温度37℃，使那些“致伤”的细菌复苏及使所有微生物生长。虽然缓冲胨水被建议常规使用(由于其可保持溶液pH值稳定)，但对培养基的选择仍存有争论。第二，是选择性增菌步骤，它使沙门氏菌生长而使肉汤中同时存在的微生物数量减少，与预增菌培养基相似，对选择性培养基的选择，也存在许多不同的观点。目前应用的主要有如下3种类型：连四硫基盐肉汤(Tetrathionate broth)、硒酸盐胱氨酸肉汤(Selenitecystine broth)和RV(Rappaport-Vassiliadis)培养基。由于没有任何一种培养基可以全面地保持所有食品基质或各种沙门氏菌血清型，所以，较适当的做法就是使用两种培养基平行地进行试验。第三步是分离步骤，即选择性培养物在含一种或多种抑制非沙门氏菌生长制剂的琼脂平板上划线培养，然后对平板上肉眼可见的特征性菌落进行确认，并对该菌落分离物进行一系列生化和血清学检测，以作出鉴定。传统沙门氏菌检测法全过程需时至少7～10天，才能得出明确的诊断结果。

以上传统的检测方法即为GB4789.4-2010是目前我国规定的对食品中沙门氏菌的标准检测方法，主要是根据沙门氏菌的生化特性，进行前增菌、选择性增菌、分离培养、生化鉴定和血清分型五个步骤。步骤繁琐，所耗时间较长，给食品检验工作带来很多不便。

近年来也出现很多新的检测方法：分子生物学方法、免疫学检测方法以及噬菌体裂解试验、葡萄球菌A蛋白协凝试验法、4-甲基伞形酮辛酯(MUCAP)试剂检测方法、电阻抗法等等，但这些方法也存在成本较高、技术较难、不便于推广等缺陷。

而涉及到沙门氏菌定量检测的就比较少了，主要就是平板计数法和传统MPN法。平板计数法是利用沙门氏菌显色培养基或XLD琼脂等，取样品液直接涂布，培养24-48小时后，计数典型沙门氏菌菌落，并进行生化鉴定和血清学鉴定，主要缺点是对于样品中沙门氏菌含量比较少时，无法计数或计数结果相差太大，即灵敏度太低。传统沙门氏菌MPN计数法是9管法，即取三个连续样品稀释度，每个稀释度三个重复，用9管TTB或SC增菌18-24小时，然后分别接种于沙门氏菌显色培养基平板或XLD琼脂平板，挑取可疑菌落鉴定后查MPN表。此法灵敏度可以，但是操作复杂繁琐，需准备大量试管、平皿等耗材，特别是样品量大时，需要大量人力和物力。

发明内容