[发明专利]一种紫娇花花蕾的组织培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及组培技术，具体涉及一种紫娇花花蕾的组织培养方法。

背景技术

紫娇花（Tulbaghia violacea Harv. (Liliaceae），别名野蒜或非洲小百合，原产南非，为石蒜科紫娇花属多年生常绿球根花卉。该植物成株丛生状，株高45～60cm；叶狭长线形，光滑，深绿色，含韭味；细长而直立的花茎自叶丛中抽出，顶端着生数十朵淡紫色小花，颇为美丽。伞形花序高于叶丛10cm以上，小花淡紫色，长2cm，具香味；适宜庭院栽植、盆栽或切花。紫娇花在华东地区5月开花，花期延续到11月；近年来紫娇花凭借其独特的观赏价值以及较强的适应性在园林绿化中应用广泛。但由于传统的分株繁殖和播种繁殖方式，使其增殖系数低，增殖周期长，故而市场缺口较大。

组织培养技术是大量快速繁殖优良种质的最有效途径，同时也是植物进行遗传改良的重要基础。而查阅国内外文献资料关于紫娇花组织培养文献有少量，仅仅Martin Fellner（1994）研究了pH值和蔗糖对紫娇花成熟花粉粒分离原生质体的影响。何月秋（2010）初步探讨了紫娇花组织培养和植株再生的技术路线，但对其快繁的研究则未见报道。因此，探索紫娇花的组培关键技术，实现其规模化繁殖，不但可丰富园林绿化植物品种，满足市场需求，也对石蒜科其它植物的组培技术研究具有重要的借鉴意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种紫娇花花蕾的组织培养方法，该方法具有灭菌效果较好，死亡率较低，原球茎质量较好，且原球茎还可增殖的优点。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种紫娇花花蕾的组织培养方法，包括下述步骤：

a、于晴天中午采下形成一周以内的紫娇花花蕾，先用洗洁精浸泡15分钟，后用流水冲洗4～5次，再用质量百分浓度为0.1%的HgCl₂和吐温80的混合溶液浸泡10分钟，无菌水冲洗5～6次，得到无菌花蕾；

b、将上述无菌花蕾接种于含有6-苄基嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）和蔗糖的诱导培养基上，诱导培养85～95天，愈伤组织形成，得到愈伤花蕾，该诱导培养基中，所述6-苄基嘌呤的浓度为3.0 mg/L，所述萘乙酸浓度为0.5 mg/L，所述蔗糖的质量百分浓度为3.0%；

c、将上述愈伤花蕾接种于含有6-苄基嘌呤、萘乙酸和蔗糖的第一分化培养基上，分化培养至原球茎形成，得到带芽的原球茎，第一分化培养基中，所述6-苄基嘌呤的浓度为3.0mg/L，所述萘乙酸浓度为0.2 mg/L，所述蔗糖的质量百分浓度为3.0%；

d、上述步骤b的诱导培养和步骤c的分化培养的培养温度都为24～26℃，光照都为2000 Lux，每日光照时间都为16 h。

将至少3个带芽的原球茎一起接种于含有6-苄基嘌呤、萘乙酸、吲哚丁酸（IBA）和蔗糖的第二分化培养基上，在培养温度为24～26℃，光照为2000 Lux，每日光照时间为16 h条件下定期培育30天，第二分化培养基中，所述6-苄基嘌呤的浓度为3.0mg/L，所述萘乙酸浓度为0.1 mg/L，所述吲哚丁酸浓度为0.05 mg/L，所述蔗糖的质量百分浓度为3.0%；该第二分化培养基可以让原球茎大量增殖，若NAA、IBA浓度均低于0.05mg.L^-1原球茎就不增殖，若NAA浓度高于0.2mg.L^-1时，原球茎虽可形成大量愈伤组织但不易分化形成不定芽；通过30天定期培育，可以让原球茎增殖一次，若需继续增殖，可重复定期培育，这样就解决了紫娇花在组织培养过程中出现的增殖能力逐渐降低的问题，提高了紫娇花原球茎的增殖系数。

上述诱导培养基和第一、第二分化培养的基础培养液为MS（Murashige and Skoog）。

与现有技术相比，本发明的优点在于一种紫娇花花蕾的组织培养方法，花蕾依次通过洗洁精、0.1% HgCl₂和吐温80的混合溶液浸泡获得无菌花蕾，灭菌效果较好，后续培养污染较少，而花蕾死亡率较低，再用诱导培养基诱导培养形成愈伤组织，得到愈伤花蕾；然后用第一分化培养基培养至原球茎形成，得到带芽的原球茎；愈伤和原球茎的分级培育，原球茎质量较好，且原球茎还可增殖。因此本发明具有灭菌效果较好，死亡率较低，原球茎质量较好，且原球茎还可增殖的优点。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例

一种紫娇花花蕾的组织培养方法，在晴天的中午，用剪刀将紫娇花形成一周以内的花蕾小心剪下带回，用洗洁精浸泡15分钟，再流水冲洗4～5次，分装好后移至超净工作台采用质量百分浓度为0.1%的HgCl₂和吐温80的混合溶液浸泡10分钟，无菌水冲洗5～6次，得到无菌花蕾，这样处理灭菌效果较佳，死亡率也较低；将无菌花蕾作为诱导愈伤组织的外植体，接种于含有6-BA、NAA和蔗糖的诱导培养基上，在培养温度为24～26℃，光照为2000 Lux，每日光照时间为16 h条件下诱导培养85～95天，50%以上已形成愈伤组织，得到愈伤花蕾，该诱导培养基中， 6-苄基嘌呤的浓度为3.0 mg/L，萘乙酸浓度为0.5 mg/L，蔗糖的质量百分浓度为3.0%；将已形成愈伤组织的愈伤花蕾再接种于含有6-BA、NAA和蔗糖的第一分化培养基上，在培养温度为24～26℃，光照为2000 Lux，每日光照时间为16 h条件下分化培养至原球茎形成，得到带芽的原球茎，第一分化培养基中， 6-苄基嘌呤的浓度为3.0mg/L，萘乙酸浓度为0.2 mg/L，蔗糖的质量百分浓度为3.0%；再可以将3个带芽的原球茎为一组接入含有6-BA、NAA、IBA和蔗糖的第二分化培养基上，在培养温度为24～26℃，光照为2000 Lux，每日光照时间为16 h条件下定期培育30天，可以让原球茎增殖一次，第二分化培养基中， 6-苄基嘌呤的浓度为3.0mg/L，萘乙酸浓度为0.1 mg/L，吲哚丁酸浓度为0.05 mg/L，蔗糖的质量百分浓度为3.0%；至少3个为一组定期培育可明显提高紫娇花原球茎的增殖系数，若低于3个生长就较慢。若需让原球茎继续增殖，可以用第二分化培养基重复定期培育，一块带芽的原球茎一年内可繁殖出20万株苗可用于生根的组培苗。