[发明专利]一种快速简便的基因克隆方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速简便的基因克隆方法，适合于从基因组DNA，cDNA文库和含有基因的载体上通过PCR方法克隆基因到目的载体上，属于基因工程和分子生物学领域。

背景技术

基因克隆是指在体外将含有目的基因或其它有意义的DNA片段与能够自我复制的载体DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行进一步研究的分子操作的过程，又称DNA克隆，分子克隆，基因操作或重组DNA技术。基因克隆主要包括目的DNA片段的获得、载体的选择、各种工具酶的选用、体外重组、导入宿主细胞和重组子的筛选。

目前PCR产物的克隆方法主要有粘性末端克隆，平末端克隆和T-末端克隆。在获得PCR产物和选择好目的载体之后，通常的方法都是用限制性内切酶同时酶切PCR产物和目的载体，然后通过琼脂糖凝胶电泳和胶回收试剂盒分离纯化酶切好的PCR产物和载体，进而继续后面的连接，转化和筛选等步骤。整个基因克隆的过程耗时较长，然而现在一些公司推出了商业化的快速限制性内切酶和快速DNA连接酶以后，使酶切和连接的时间都能缩短到十分钟左右的时间完成，这时琼脂糖凝胶电泳和胶回收就成为基因克隆耗时最长的步骤了。

另外，目前最方便快捷的基因克隆方法是A-T克隆法。商业化的T载体是能较快的用于克隆基因，但是采用T载体克隆一方面增加了基因克隆的步骤，还需要进一步把目的DNA片段克隆到目的载体上，增加了整个基因克隆的步骤和时间；另一方面不仅增加了成本，而且不适合于用单一的具有3’～5’校正酶活性的DNA聚合酶扩增的PCR产物进行克隆。

发明内容

本发明目的是解决现有基因克隆过程耗时较长的问题，提供一种快速简便的基因克隆方法。

本发明提供的快速简便的基因克隆方法首先利用快速限制性内切酶系统酶切目的DNA（PCR产物）和载体DNA，酶切体系如下：

载体（或PCR产物）       5～20ng（或5-20ul）

10×酶切缓冲液            2.5μl

内切酶1                  1.5μl

内切酶2                  1.5μl

双蒸水              补足至25μl

然后利用苯酚和氯仿抽提、乙醇和醋酸钠沉淀DNA的方法来回收酶切的DNA片段，其抽提沉淀体系如下：

载体酶切产物抽提上清             20μl（依据上面的酶切体系大小而定）

基因片段酶切产物抽提上清         20μl（依据上面的酶切体系大小而定）

乙酸钠                            4μl（1/10上清总体积）

冷乙醇                           80μl（2倍上清总体积）

进而离心沉淀得到目的DNA和载体DNA酶切产物的混合物，室温干燥后进行连接，其连接体系如下：

沉淀                     0μl

5×连接缓冲液            2.0μl

连接酶                   0.5μl

双蒸水              补足至10μl

最后，连接产物转化大肠杆菌，第二天用菌落PCR方法筛选阳性克隆。

本发明方法的具体操作步骤如下：

第1、通过PCR获得目的DNA片段并选择好目的载体；

第2、取载体DNA和PCR产物分别进行快速的限制性内切酶反应，酶切完成后分别加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1的混合液，然后涡旋混匀进行抽提；

第3、将第2步抽提得到的上清取出置于一个新的离心管中混合，再加入pH5.2的乙酸钠和冷乙醇沉淀酶切后的DNA，混匀后置于-20℃或者-70℃放置半个小时，然后离心去上清，于室温晾干DNA沉淀，加入适量的去离子水溶解DNA，再加入连接缓冲液和DNA连接酶，然后继续后面的连接、转化和筛选等步骤。

本发明方法可用于各种基因克隆或者亚克隆实验的中间步骤。

本发明的优点和积极效果：

本发明是利用生物化学的方法，找到了一种替换琼脂糖凝胶电泳和胶回收分离纯化DNA片段的方法，简化了基因克隆的步骤，使整个基因克隆的过程更加简便快速。在本发明中，不需要对酶切产物进行切胶回收，而是采用抽提沉淀DNA的方法。