[发明专利]致病性弧菌通用检测法及所用的核酸等温扩增检测试剂盒

权利要求书

1.一种海水养殖动物致病性弧菌核酸等温扩增通用检测试剂盒，其特征是包括：

    (1)、研磨液管：内装研磨液， 

    (2)、核酸提取液A管：内装乙酸钠溶液， 

    (3)、核酸提取液B管：内装无水乙醇，

    (4)、核酸提取液C管：内装质量浓度70%的乙醇溶液， 

    (5)、TE缓冲液管：内装TE缓冲液；

    (6)、UNG酶管：内装尿嘧啶DNA糖基化酶；

    (7)、LAMP反应液管：内装LAMP反应液；

    (8)、Bst DNA聚合酶管：内装Bst DNA聚合酶；

    (9)、显色剂管：内装核酸染料SYBR Green I；

    (10)、阳性对照核酸管：内装弧菌阳性DNA；

   (11)、阴性对照管：内装灭菌的双蒸水。

2.根据权利要求1所述的海水养殖动物致病性弧菌核酸等温扩增通用检测试剂盒，其特征是：所述研磨液是由以下体积的组分组成： 1~2 M的三羟甲基氨基甲烷溶液5~10份，0.25~1.0M的乙二胺四乙酸二钠溶液0.5~2.0份，质量浓度5~10%的十二烷基磺酸钠溶液 5~10份，巯基乙醇0.01~1.0份，8-羟基喹啉0.01~0.02份，平衡酚5~10份和氯仿5~10份，用双蒸水定容到100份。

3.根据权利要求2所述的海水养殖动物致病性弧菌核酸等温扩增通用检测试剂盒，其特征是：所述LAMP反应液由以下组分组成：LAMP引物VIBRIO-FIP和VIBRIO-BIP各1~4 μM，LAMP引物VIBRIO-F3和IVIBRIO-B3各0.1~0.5 μM，dATP、dGTP和dCTP各0.5~2 mM， dTTP、dUTP各0.25~1 mM，Tris-HCl 10~40 mM，KCl 10~20 mM，(NH₄)₂SO₄ 5~15 mM，MgSO₄ 1~4 mM，Triton X-100 0.05%～1.0%，Betaine 0.8~1.2 M；其余为双蒸水。

4.根据权利要求3所述的海水养殖动物致病性弧菌核酸等温扩增通用检测试剂盒，其特征是：所述LAMP引物的核酸序列如下：

VIBRIO-FIP：

5'- CGGCTGCTGGCACGGAGTTTTTGCATTATTTGACGTTAGCGACAGAAG；

VIBRIO-BIP：

5'- GAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCTTTTCCGGGCTTTCACATCTGACTTAAC；

VIBRIO-F3: 

5'- CAGTCGTGAGGAAGGTGGTGT；

VIBRIO-B3: 

5'- CTAGTCTGCCAGTTTCAAATGCT。

5.利用如权利要求1~4中任意一种检测试剂盒进行海水养殖动物致病性弧菌的检测方法，包括下列步骤：

 (1)、取待测样品组织0.2g置于离心管                                                中，加入0.5 ml研磨液，用研磨棒充分磨碎至浆状；

 (2)、将上述研磨所得的浆状样品煮沸(100℃，l0 min)后以10000 r/min离心5 min，取上清液置于离心管中；

(3)、向离心管内加入核酸提取液A管内的乙酸钠溶液混匀，所述乙酸钠溶液与上清液的体积比为1/10 ；再加入-20℃预冷的核酸提取液B管内的无水乙醇混合，静置10 min，以12000 r/min离心5min，弃上清液，保留沉淀物，所述无水乙醇与上清液的体积比为2：1；

 (4)、用核酸提取液C管内的乙醇溶液洗涤上述步骤（3）所得的沉淀物，然后以12000 r/min离心5 min，弃上清液，保留沉淀物；

(5)、用核酸提取液C管内的乙醇溶液洗涤上述步骤（4）所得的沉淀物，然后以12000 r/min离心5 min，弃上清液，保留沉淀物；

(6)、将上述步骤（5）所得的沉淀物于室温晾干，加入20 μl TE缓冲液溶解沉淀物，得到样品核酸；

(7)、分别将上述样品核酸、阴性对照管内的双蒸水、阳性对照核酸管内的阳性对照核酸2 μl，加至21μl LAMP反应液中，再加入1μl UNG酶，分别得检测管、阴性对照管和阳性对照管；对上述检测管、阴性对照管和阳性对照管均于37℃ 保温10 min进行酶解；

 (8)、将上述检测管、阴性对照管和阳性对照管酶解后的反应体系分别进行如下操作：先于95℃保温5 min，然后再迅速置于碎冰块中5 min；

(9)、向步骤（8）所得的检测管、阴性对照管和阳性对照管的反应体系中再分别加入1μl Bst DNA聚合酶；

(10)、将上述步骤（9）所得的检测管、阴性对照管和阳性对照管分别进行如下操作：先于64 ℃保温45 min，然后于90 ℃保温2 min完成LAMP反应；

(11)、LAMP反应结束后，加入1μl核酸染料SYBR Green I，如果检测管内LAMP反应产物的颜色与阴性对照管反应产物的颜色均呈橙色，则待测品致病性弧菌检测结果为阴性；如果检测管内LAMP反应产物的颜色同阳性对照管反应产物的颜色均呈绿色，则待测品致病性弧菌检测结果为阳性。