[发明专利]一种简单、快速制备即用esiRNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及小RNA的制备方法，特别涉及一种简单、快速、低成本的制备即用(ready-to-use)esiRNA的新方法。

背景技术

RNA干扰(RNA interfering，RNAi)是由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发引起同源mRNA高效特异性降解的现象，是生物界一种古老而且进化上高度保守的基因表达调控机制。1998年研究者发现在C.elegans或果蝇中注入dsRNA可特异性抑制基因表达，并将这种由dsRNA引发的抑制特定基因表达的现象成为RNAi。随后RNAi的基础研究和应用迅速成为生命科学的热点领域之一。RNAi研究取得了突破性进展，被《Science》杂志评为2001年的十大科学进展之一，并名列2002年十大科学进展之首。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。

RNAi干扰技术沉默基因具备简单、高效、快速等特点，使得大规模使用这种技术成为可能。近年来，有不同规模和形式的siRNA表达文库被建立起来。针对每一条基因，合成对应的siRNA是目前常用的方法。Dharmacon，Ambion以及Sigma等公司甚至提供全基因组siRNA文库。利用siRNA文库在全基因组筛选功能基因已经取得一些令人瞩目的结果，目前化学合成的siRNA和shRNA已经成为哺乳动物细胞RNAi最常用的、得到充分表征的介质。通过核酸内切酶制备的siRNA(endoribonuclease-prepared siRNA，esiRNA)是一种使用细菌核糖核酸酶III(RNase III)酶消化长链dsRNA而得到的siRNA，由于这种siRNA具有较低的脱靶效应以及成本较低，最近得到较多的关注。这种siRNA类似物的混合物分子由多种异源的RNA片段组成，但是它们的目标转录物却是相同的，这个特点赋予了它们很高的沉默效力以及比化学合成siRNA低12倍的脱靶效应。基于siRNA库的全基因组RNAi筛选已经被证明了能够发现在细胞分裂中未知的组分、DNA修复、转铁蛋白(transferrin，TF)、表皮细胞生长因子(EGF)相关的内吞贩运。

然而，现有技术制备esiRNA是一个相当复杂的过程，包括至少6个步骤：PCR扩增、转录、酶消化、纯化、esiRNA定量化以及归一化(图1)，这些步骤包括需要对液体样品进行转移、纯化、定量化和归一化等操作，需要使用昂贵的仪器，例如液体处理系统、离心机和光谱仪。这些繁琐而昂贵的工作严重影响了esiRNA大规模的制备和应用。另一个方面，业内急切需要对esiRNA的性能评测和提高进行广泛和深入的研究。

发明内容

本发明的目的正是为了解决上述技术问题，提供一种简单、快速、廉价的制备即用(ready-to-use)esiRNA的新方法。本发明采用集成了高分子微球(高分子块体)的芯片对esiRNA进行简单、快速、廉价的制备，利用这个芯片在聚合物支架上进行扩增、转录和酶消化，从而简化了液体转移和纯化等操作步骤，将esiRNA的制备方法由现有技术的6个步骤缩减为本发明的3个步骤，大大简化了esiRNA的制备过程；同时，利用该芯片可以对esiRNA产物的量进行裁剪和归一化，使得esiRNA无需进一步的处理就可以直接用于功能丧失(loss-of-function)研究。

在本发明中，术语“小RNA”指的是核苷酸数目较少的RNA，包括但不限于微小RNA(microRNA，简称miRNA)、小型干扰RNA(short interfering RNA，简称siRNA)、小核RNA(small nuclear RNA，简称snRNA)、小时序RNA(small temporal RNA，简称stRNA)、piwi蛋白作用的RNA(Piwi-interacting RNA，简称piRNA)等。

“U”是酶的单位，定义为在最适反应条件下，1小时完全降解1mg DNA的酶的量。