[发明专利]重组人源无标签SDF-1在大肠杆菌中的表达及纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及在大肠杆菌中表达、纯化得到高质量人源无标签SDF-1的方法。

技术背景

趋化因子是一类控制细胞定向迁移的细胞因子。SDF-1是趋化因子亚家族CXC中的成员。因为SDF-1及其受体CXCR4信号通路在发育、炎症的发生、血管的生成、肿瘤的发生以及HIV的感染等众多生理、病理过程中发挥重要作用，所以SDF-1已被广泛应用于科研以及疾病的临床诊断过程中。

已有的研究工作发现SDF-1基因通过不同剪切形式可以编码成六种不同的异构体(isoform)，其中alpha-异构体和beta-异构体发现最早，相应的研究工作也最为深入。已有的研究工作发现，成熟有活性的SDF-1alpha由68个氨基酸组成，SDF-1beta相比SDF-1alpha在其N端多出4个氨基酸。

国际上，SDF-1现有的生产方式主要有3种形式，分别是化学合成、在大肠杆菌中以包涵体的形式过表达以及真核表达。其中化学合成以及真核表达存在产量低、成本高等工艺缺点。目前，在大肠杆菌中的表达主要采用稀释复性的工艺方法，该方法在工艺过程中需要进行多次浓缩、多次纯化，工艺周期长、生产成本高、溶液体系大。另一方面，目前市面销售的无标签SDF-1价格奇高，产品质量参差不齐。上述这些问题都极大限制了SDF-1在科研及工业上的应用。

发明内容

本发明的目的在于实现一种从大肠杆菌中表达、纯化获取高质量重组人源无标签SDF-1的简便化方法。本发明提供的工艺方案在实际生产过程中的生产周期大幅缩短，具有生产成本低、产品得率高、产品品质优异的特点。

本发明提供一种重组人源无标签SDF-1在大肠杆菌中的表达及纯化方法，其特征在于该方法通过如下步骤实现重组人源无标签SDF-1在大肠杆菌中的表达及纯化：

(1)将PCR合成的无标签SDF-1基因构建于表达载体pET28a，然后通过菌液来培养pET28a-SDF-1质粒，再经过IPTG诱导表达目的蛋白；

(2)通过超声方法来破碎菌体，在沉淀物中得到目的蛋白，经洗涤沉淀后得到包涵体，再利用盐酸胍对包涵体进行变性；

(3)通过乙酸透析，对包涵体进行复性；

(4)通过强阳离子交换树脂(SP-bestraose)进行第一步纯化；

(5)通过Akta Purifier分子筛进行第二步纯化，得到高质量的人源无标签SDF-1。

所述SDF-1是从大肠杆菌高效表达的包涵体中进行制备纯化的。

所述SDF-1的表达温度为37℃。

所述SDF-1的纯化温度为室温或4℃。

所述经过纯化的高质量SDF-1液氮冷激后于-80℃保存。

本发明所提供的重组人源无标签SDF-1在大肠杆菌中的表达及纯化方法，包括了表达载体的构建、蛋白的诱导表达、包涵体的制备、乙酸透析复性、离子交换纯化以及分子筛纯化等5个步骤。

其以合成的人SDF-1基因作为模板，通过PCR的方法扩增获得两端带有限制性内切酶Nco I/Eco RI的基因片段，使用NcoI/EcoRI将目的基因插入到pET28a表达载体；以大肠杆菌菌株BL21(DE3)作为表达菌株，经过IPTG的诱导，目的蛋白以包涵体的形式过表达；溶菌酶处理加上超声破碎的方法使得包涵体能从大肠杆菌中彻底释放。继而，通过盐酸胍溶液来溶解包涵体，将蛋白在乙酸中进行透析以去除变性剂，在PBS中完成透析复性。

本发明应用强阳离子交换树脂(SP-bestarose)对目的蛋白进行第一步纯化，根据SDS-PAGE的结果将分离组分合并、浓缩，通过分子筛进行第二进行纯化，最终获得高纯度、高活性的无标签SDF-1。

采用本发明所提供的方法，可以通过大肠杆菌高效表达人源重组的无标签SDF-1，通过乙酸透析法进行复性，使用强阳离子交换树脂进行第一步纯化，再用分子筛对复性蛋白第二步纯化从而获得高质量的蛋白。本项技术应用于无标签SDF-1的大规模生产，可明显缩短生产周期，降低生产成本，提高产品质量。

具体实施方式

实施例：

1、表达载体的构建：