[发明专利]一种密码子优化的β-葡萄糖苷酶Mbg1基因及其表达

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种密码子优化的β-葡萄糖苷酶Mbg1基因及其表达。

背景技术

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC3.2.1.21)，又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，是纤维素酶的一个关键组分，它能够催化水解芳基或烃基与糖基原子团之间的糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁汁中发现了β-葡萄糖苷酶。后来的研究发现，β-葡萄糖苷酶广泛存在于植物、动物和微生物中，它参与生物体的糖代谢和胞内信号传导等，对维持生物体正常生理功能起着重要作用。β-葡萄糖苷酶在食品、饲料、医疗、生物能源等领域具有重要的应用价值。在食品工业中，β-葡萄糖苷酶能将水果、蔬菜、茶叶中的风味前体物质转化为具有浓郁天然风味的香气物质，用于食品增香；β-葡萄糖苷酶可以帮助多酚葡萄糖昔转化为游离多酚，以提高多酚的生物活性或者帮助分离分析多酚；水解含有氰醇与葡萄糖形成的糖苷，消除不稳定氰醇的毒性等。在饲料工业中，β-葡萄糖苷酶可以用于对饲料中纤维素的降解，促进猪、鸡等非反刍动物影响的吸收；在生物能源领域，β-葡萄糖苷酶是纤维素转化生成乙醇的关键酶之一，通过水解纤维素分解过程中的纤维二糖，可以有效地减少纤维二糖纤维素酶的抑制作用。此外，β-葡萄糖苷酶在合成低聚龙胆糖等寡糖和相关的糖复合物中有广泛的应用前景。

相对于真表达系统而言，大肠杆菌作为一种非常成熟的原核表达系统有诸多优点：1)对大肠杆菌的遗传背景和生理特性研究已相当彻底，已有很多不同抗药性、不同营养依赖型和不同校正突变型的菌种供选择应用，可以根据不同的载体而选择不同的菌种；2)尽管大肠杆菌细胞的空间小，但繁殖能力强，在营养条件充足时，20～30min即可繁殖一代，而且大规模发酵成本低，具有巨大的生产潜力；3)表达水平一般较真核系统高，某些外源基因在大肠杆菌中的表达量可达总蛋白的5％～30％，且下游工艺简单、易于控制。因此，大肠杆菌是生产β-葡萄糖苷酶较为理想的表达系统。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种密码子优化的β-葡萄糖苷酶Mbg1基因及其表达，所述β-葡萄糖苷酶Mbg1基因通过连续延伸PCR方法合成，并将本发明合成的β-葡萄糖苷酶Mbg1基因转化入大肠杆菌EG50中表达出高比活的β-葡萄糖苷酶。

为达到上述目的，本发明通过以下技术方案来实现：

所述β-葡萄糖苷酶Mbg1基因的核苷酸序列SEQ ID NO 1所示。

所述β-葡萄糖苷酶Mbg1基因的核苷酸序列编码的蛋白质序列如SEQ ID NO 2所示。

本发明按照偏爱密码子对野生型的Mbg1基因进行改造，改造后的基因序列与野生型序列(GenBank Accession No.CP000749)同源性为80％(参见图1)，其编码的蛋白质共447个氨基酸。

本发明的经密码子优化的β-葡萄糖苷酶Mbg1基因合成采用连续延伸PCR方法。两侧引物分别加入BamHI和SacI酶切位点，使用的引物如下：

P1：GGA，TCC，ATG，TCT，ATC，ACT，CTT，CCA，TCT，CAC，TCC，AAG，ATG，CTG，ACC，TCC，GAC，TTC，ATC，TTT

P2：TGG，TAG，CAC，CTT，CAA，TCT，GGA，AAG，AGG，CAG，TAG，CAA，CAC，CAA，AGA，TGA，AGT，CGG，AGG，TCA

P3：CCA，GAT，TGA，AGG，TGC，TAC，CAC，TGC，TGA，CAA，CAG，ACT，CCC，ATC，CAT，CTG，GGA，TAC，CTT，CTG

P4：CTC，ACC，ATT，GTC，CAT，ACC，TTT，GAC，CTT，GCC，TGG，AGT，AGC，ACA，GAA，GGT，ATC，CCA，GAT，GGA

P5：AAG，GTA，TGG，ACA，ATG，GTG，AGA，TTG，CTT，GTG，ACC，ACT，ATC，ATC，TCT，GGG，AAC，AAG，ACA，TTC

P6：GAG，AGT，CTG，TAG，GCA，TCA，ACA，CCA，AGG，TCT，TTG，ATC，AGC，TGA，ATG，TCT，TGT，TCC，CAG，AGA

P7：GTT，GAT，GCC，TAC，AGA，CTC，TCC，ATT，GCT，TGG，CCA，AGA，GTC，ATG，GAC，AAG，AAA，GGT，GAA，GCT