[发明专利]具高肠毒杀虫活性的转基因生防真菌及其构建法和用途

权利要求书

1.具高肠毒杀虫活性的转基因生防真菌，其特征是：菌株BbHV8的保藏名称为：球孢白僵菌Beauveria bassiana；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2010年12月8日，保藏编号：CGMCC No. 4438。

2.根据权利要求1所述的具高肠毒杀虫活性的转基因生防真菌的构建方法，其特征是包括以下步骤： 

（1）获得内源强启动子：

利用球孢白僵菌疏水蛋白基因hyd1的序列设计引物，克隆其N端启动子全长序列Phyd1；不同长度或实施转录因子定点突变的启动子片段通过其启动外源报告基因的表达进行定量比较，找到启动绿色荧光蛋白表达量最大的启动子片段为球孢白僵菌疏水蛋白启动子Phyd1的优化片段，所述球孢白僵菌疏水蛋白启动子Phyd1的优化片段作为Phyd1优化后的强启动子核心序列，该片段携带3个缺一不可的转录因子；

（2）获得异源杀虫蛋白基因：

针对目标害虫选择适当的Vip3A杀虫蛋白基因，构建合适的酶切位点，用合成的方法获得目标蛋白基因Vip3Aa1，所述Vip3A为杀虫蛋白家族成员之一；

（3）构建携带Vip3A蛋白基因和选择标记基因的二元表达载体：

将步骤（2）所得的目标蛋白基因Vip3A置于步骤（1）所得的球孢白僵菌疏水蛋白启动子Phyd1的优化片段以及构巢曲霉（Aspergillius nidulans）色氨酸基因的终止子TtrpC之间；然后与生防真菌筛选标记草丁膦抗性基因bar表达元件串联成二元表达载体；

（4）获得生防真菌的重组工程菌株：

将步骤（3）构建所得的二元表达载体转入生防真菌，筛选后获得组成型超高表达Vip3A蛋白基因的重组工程菌株——保藏名称为：球孢白僵菌Beauveria bassiana的菌株BbHV8。

3.根据权利要求2所述的具高肠毒杀虫活性的转基因生防真菌的构建方法，其特征是：所述步骤（4）中的生防真菌为昆虫病原真菌的菌种菌株，所述昆虫病原真菌为白僵菌属Beauveria、绿僵菌属Metarhizium、棒束孢属Isaria或蜡蚧菌属Lecanicillium。

4.根据权利要求3所述的具高肠毒杀虫活性的转基因生防真菌的构建方法，其特征是：将步骤（3）构建所得的二元表达载体转入生防真菌的方法为：原生质体转化、农杆菌介导转化、芽生孢子转化或电击转化。

5.如权利要求1所述的具高肠毒杀虫活性的转基因生防真菌的用途，其特征是：用于肠毒杀虫。