[发明专利]一种检测和鉴别蚊媒体内疟原虫子孢子的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测和鉴别蚊媒体内疟原虫子孢子的方法。

背景技术

疟疾是严重危害人类健康的虫媒传染病，每年3-5亿人发病，至少100万人死于疟疾。世界卫生组织(WHO)已将疟疾和艾滋病、结核病一起，列为全球三大公共卫生问题。引起疟疾的人体疟原虫有4种，分别是间日疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫。

按蚊是疟疾唯一的传播媒介，媒介控制措施对全球控制和消除疟疾目标的实现具有重要意义(Greenwood，B.M.Control to elimination：implications for malaria research[J].Trends Parasitol，2008，24(10)：449-454；WHO Study Group.Malaria vector control and personal protection [J].World Health Organ Tech Rep Ser，2006，936：1-62)。有效的媒介控制措施很大程度上依赖于准确的媒介调查。对传疟媒介的密度、种群分布、生态习性、季节消长及其按蚊子孢子感染等情况的调查不仅是制订和实施综合媒介控制措施所必需的科学依据，同时也为疟疾流行态势的分析和有效疟疾防治策略的制订提供必要的参考信息(Beier，J.C.，J.Keating，J.I.Githure，et al.Integrated vector management for malaria control[J].Malar J，2008，7(1)：S4)。按蚊子孢子感染率是评价某种按蚊传播疟疾能力的直接指标，也是评价疟疾控制效果和进行疟疾监测的重要内容。

传统的蚊体内疟原虫检测方法是采用显微解剖方式，观察蚊胃卵囊和蚊唾液腺子孢子情况。按蚊解剖和卵囊/子孢子检测不仅需要新鲜的按蚊样本，而且需要熟练的专业实验操作技术。我国主要为间日疟流行，目前我国大多数间日疟流行区的疟疾发病率不高，按蚊子孢子阳性率往往低于1/1000，采用传统的按蚊解剖方式检测卵囊/子孢子费时、费力，已经不适合用于现场媒介调查。同时，由于这种传统技术不能鉴别疟原虫种，在间日疟/恶性疟混合流行区其检测结果为疟疾防治提供的信息有限。免疫学方法检测稳定性较差，假阳性偏高等缺点，限制了其在现场媒介调查中推广应用(Lochouarn，L.D.Fontenille.ELISA detection of malaria sporozoites：false-positive results in Anopheles gambiae s.l.associated with bovinebloodmeals[J].Trans R Soc Trop Med Hyg，1999，93(1)：101-102)。目前已有采用敏感性和特异性较高的巢式PCR技术检测蚊体内疟原虫的报道，但由于该技术需要进行两轮PCR反应，操作繁琐，不适合高通量检测(Li，F.，C.NiuB.Ye.Nestedpolymerase chain reaction in detection of Plasmodium vivax sporozoites inmosquitoes[J].Chin Med J(Engl)，2001，114(6)：654-657)。为此，现场媒介监测迫切需要开发敏感、特异、简便快速的蚊体内疟原虫检测和鉴别技术。荧光定量PCR技术是一种先进的核酸定量检测技术，其通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，既能进行定性分析又能进行定量检测。与常规PCR相比，荧光定量PCR具有敏感性和特异性更高、不需进行凝胶电泳分析、操作简便、快速高效等特点。目前该技术已广泛应用于生物学及医学研究，并且在多种疾病的临床检验诊断中推广应用(欧阳松应，杨冬，欧阳红生，等.实时荧光定量PCR技术及其应用[J].生命的化学，2004，24(1)：74-76)。在疟疾研究和应用方面，国内外学者利用该技术在疟疾病人诊断、抗疟药疗效考核、疟疾疫苗效果评价等方面进行了一些探索，均取得了较好的效果(Swan，H.，L.Sloan，A.Muyombwe，et al.Evaluation of a real-time polymerase chain reaction assay for the diagnosisof malaria in patients from Thailand[J].Am J Trop Med Hyg，2005，73(5)：850-854；Rougemont，M.，M.Van Saanen，R.Sahli，et al.Detection of fourPlasmodium species in blood from humans by 18S rRNA gene subunit-based andspecies-specific real-time PCR assays[J].J Clin Microbiol，2004，42(12)：5636-5643；Andrews，L.，R.F.Andersen，D.Webster，et al.Quantitative real-timepolymerase chain reaction for malaria diagnosis and its use in malaria vaccineclinical trials [J].Am J Trop Med Hyg，2005，73(1)：191-198；Witney，A.A.，D.L.Doolan，R.M.Anthony，et al.Determining liver stage parasite burden by real time quantitative PCR as a method for evaluating pre-erythrocytic malaria vaccine efficacy[J].Mol Biochem Parasitol，2001，118(2)：233-245.)。目前国外已有采用荧光定量PCR技术检测蚊体内恶性疟原虫的报道，其缺点是不能进行虫种鉴别(Bell，A.S.L.C.Ranford-Cartwright.A real-time PCR assay forquantifying Plasmodium falciparum infections in the mosquito vector[J].IntJ Parasitol，2004，34(7)：795-802)；Bass等(Bass，C.，D.Nikou，A.M.Blagborough，et al.PCR-based detection of Plasmodium in Anopheles mosquitoes：a comparison of a new high-throughput assay with existing methods[J].Malar J，2008，7：177)建立了Taqman探针荧光定量PCR技术用于检测蚊体内疟原虫，并进行虫种鉴别，但由于Taqman探针成本高，并不适合大样本检测和现场应用。目前尚没有采用成本较低、操作简便的基于SYBR Green I染料法荧光定量PCR技术检测并鉴别四种蚊体内疟原虫子孢子的报道。