[发明专利]检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的ELISA试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种ELISA试剂盒，具体涉及检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的ELISA试剂盒及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)主要引起妊娠母猪早产、流产、死胎、木乃伊胎及产弱仔猪等繁殖障碍，仔猪和育肥猪主要表现为咳嗽、呼吸困难。本病于1987年首次在美国爆发(Keffaber K K.，1989)，随后迅速遍及全球各个养猪业发达的国家和地区，给世界的养猪业带来了巨大的经济损失。本病的病原是猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)，属于套式病毒目动脉炎病毒科(Arteriviridae)动脉炎病毒成员(Cavanagh，1997；Snijderand Meulenberg，1998)。根据病毒基因组核苷酸序列的差异，将其分为北美洲型和欧洲型两个基因型，PRRSV包括8个开放阅读框。由ORF5基因编码的囊膜糖蛋白GP5大约由200个氨基酸组成，分子量大小约为25kD，是病毒主要的免疫原性蛋白。近年来人们不仅在研究该蛋白的免疫学特性上进行了大量的探索，而且在对其抗原特性的研究上也一直给予了极大关注。

我国于1996年首次报道有该病的发生，并且证明是北美洲型PRRSV毒株感染所致(郭宝清，1996；杨汉春，1997)。2006年夏天出现的“高致病性蓝耳病”给我国的养猪业造成极大的危害和重大的经济损失。此次发病和以往的经典毒株有很大的不同，不同日龄、不同品种的猪均可感染，而且来势凶猛、发病突然、传播迅速、死亡率高、治愈率低，严重影响了农民增收及养猪业的生产安全。

应用各种免疫血清学技术对疫病做出准确、迅速的诊断是预防和控制该病的重要措施之一。目前，针对PRRS的诊断方法应用最为广泛的是以全病毒作为包被抗原建立的ELISA方法，如：美国IDEXX公司生产的间接ELISA试剂盒。由于病毒需由细胞培养物中大量增殖，而真正意义上的纯化病毒很难获得。该试剂盒的检测费用过高，昂贵的检测费用使许多基层单位难以接受，使其不利于基层的推广和应用。随着亚单位疫苗和核酸疫苗研究的出现，能够提供相应蛋白包被的试剂盒也成为了必要。

发明内容

针对上述不足与需要，本发明提供一种检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的ELISA试剂盒及其应用，用于抗体的检测。该试剂盒操作简单，稳定性和重复性好，检测成本低廉，市场前景良好。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明提供一种检测猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive andrespiratory syndrome，PRRS)抗体的ELISA试剂盒，包括以下组分：

(1)ELISA板条：以猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白基因的重组GP5蛋白作为包被抗原，每一试剂盒装有4块经1％(M/V)牛血清白蛋白(BSA)封闭的板条，以包装袋密封包装于4℃保存；

(2)洗涤液：1倍浓度的pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)溶液；

(3)血清稀释液：1％(M/V)BSA 100毫升；

(4)显色底物：已加入H₂O₂的四甲基联苯胺(TMB)溶液100毫升，其中每10毫升溶液TMB中含有30％(M/V)浓度H₂O₂15μL；

(5)兔抗猪酶标二抗：已用血清稀释液1％(M/V)BSA稀释至工作浓度1∶800的兔抗猪酶标二抗100毫升；

(6)终止液：2M H₂SO₄溶液100毫升；

(7)PRRS阳性血清：5毫升；

(8)PRRS阴性血清：5毫升。

本发明的ELISA试剂盒可用于检测猪繁殖与呼吸综合征抗体，主要检测步骤如下：

(1)加入血清样品

用血清稀释液1％(M/V)BSA将被检血清作1∶50倍稀释后，每孔加入100μL，每一血清样品添加两孔，同时设立PRRS阴、阳性血清作为对照，各添加两孔；室温下作用45min，弃去反应孔中的液体；将每个孔用约200μL的洗涤液充分清洗3-5次，每次持续4-5min，在每次洗涤后将反应孔中的液体除去，最后一次除去洗涤液后，除去残留的液体；

(2)加入兔抗猪酶标二抗：