[发明专利]利用EST-SSR分子标记构建荔枝核心种质的方法

说明书

技术领域

本发明涉及荔枝核心种质的构建方法。

背景技术

荔枝(Litchi chinensis Sonn.)为无患子科(Sapindaceae)荔枝属(Litchi)植物，原产于我国南部，是重要的热带亚热带水果，也是世界最古老的栽培果树之一，分布于东、西半球的热带和亚热带的广阔地区， 我国荔枝主要分布在北纬18°～24°30′的热带亚热带地区，主要栽培省份是广东、广西、福建、海南、台湾、云南，此外，在四川、贵州、浙江的一些特殊小气候区也有少量种植（张展薇等，1997）。吴淑娴等(1996)年对各地的荔枝种质资源进行了统计认为我国已发现的荔枝种质达222份，现已增加至300多份（陈洁珍等 2003）。其中，广东荔枝栽培面积最大，品种资源丰富，栽培品种也较多，目前，我国荔枝种质资源保存主要是利用种质资源圃。1988年建立的广州荔枝圃到目前为止保存了包括广东、广西、福建、四川、云南等地的野生、半野生和栽培品种等130多份种质，是世界上最大的荔枝种质基因库。

荔枝现存资源保存方式单一，各地几乎仅采用建立资源圃进行田间种植保存，而且资源的重复保存现象较严重；其保护力度也远远不够，荔枝的遗传多样性遭到严重的破坏（王艳琼 2008）。此外，由于荔枝是多年生木本植物，树体大，作为资源保存，占地面积大，随着近年来遗传资源数量的增加也给种质资源的保存、研究与利用带来了很大的困难。

Frankel(1984)最早提出核心种质(Core collection)即是以最小的资源份数和遗传重复最大限度地代表该物种的遗传多样性。核心种质的构建能有效解决资源的重复保存，且由于资源数量大给育种工作者带来的困难也能随之解决。

传统的核心种质的是用农艺学和形态学数据来构建的，但这些表型数据不能准确的反应群体固有的遗传变异及材料间的遗传关系（Gu et al，2005），与表型数据相比，DNA分子标记数据能直接反映出DNA序列水平上的变化，是构建核心种质的有效特征数据(李银霞等 2007)。

目前，核心种质已成为国际遗传资源研究的热点，在水稻等许多一年生作物上得到广泛应用（Chandra 2002；Amalraj 2006；Juneja 2006；Ronfort 2006；Upadhyaya 2007），在园艺作物花卉郁金香（Raamsdonk 2000）、梅花（明军 2005）和蜡梅（赵冰 2007）等上也有报道，在果树上，仅在苹果（Hokanson 1998）、果梅（高志红等 2008）、柚类（刘勇 2006）和桃（李银霞等 2007）上有少量报道。

现阶段，缺乏荔枝核心种质与分子指纹的构建方法。

发明内容

本发明的目的在于提供荔枝核心种质与分子指纹的构建方法。

本发明所采取的技术方案是：

荔枝核心种质的构建方法，包括以下步骤：

1)  选取荔枝的嫩叶，按品种提取其基因组DNA，得到荔枝的基因组DNA样品；

2)  根据荔枝的EST序列，搜索荔枝的EST-SSR，设计EST-SSR引物；

3)  使用EST-SSR引物进行PCR，扩增荔枝的基因组DNA；

4)  对PCR产物进行电泳分析，得到其等位基因的存在数据；

5)  对获得的数据进行分析处理，构建核心种质。

优选的，PCR的扩增程序为：94℃，4min；94℃，1min；50℃，1min；72℃，2min；35个循环；72℃，10min；4℃，完成扩增。

本发明方法中，EST-SSR标记的引物形成和实验操作过程简单，易操作，扩增谱带清晰，结果稳定，适合于分析荔枝资源之间的遗传多样性，在此基础上构建的核心种质几乎代表了原种质全部的遗传多样性，有很好的代表性，对荔枝种质管理、新种质收集及种质繁殖更新具有现实意义，更重要的是促进了荔枝种质资源利用的深入，从而提高荔枝种质资源的利用效率。

附图说明

图1是三种相似系数下抽取不同样品数保留的等位基因数。

图2是三种系数下构建的核心种质与原种质的主坐标图。

图3是9个EST-SSR标记的多态性类型分类简图。

图4～6分别是使用EST-SSR标记EST-21、EST-29、EST-30对96份荔枝种质资源进行PCR产物的电泳分析图。

具体实施方式

下面结合实施例，进一步说明本发明。

1 材料与方法

1.1植物材料：