[发明专利]一种猪肺炎支原体培养基及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于兽医生物学技术领域，涉及一种猪肺炎支原体培养基及其制备方法。

背景技术

猪肺炎支原体是引起猪的接触性慢性呼吸道疾病的重要病原之一，是全世界广泛存在严重危害养猪业健康发展的主要猪病病原之一，其主要危害是引起猪的生长受阻、饲料转化率大幅下降，继发引起其他疾病的发生并加重发病症状。猪支原体肺炎灭活疫苗可以减少喘气病的发生，但优质疫苗的前提需要有一种好的培养基来支撑。

培养基是人工合成各种营养物质供微生物生长的基质。支原体是一种微小原核生物，无细胞壁，可在人工培养基上生长，形成小菌落，但培养条件要求十分苛刻，且生长速度慢，从而难以培养，这样对防治猪气喘病的研究造成困难。

1964年Goodwin等首先使用煮沸猪肺组织的灭活细胞培养基成功进行猪肺炎支原体的分离培养。1965年Switer氏等和Goodwin等都各自成功地研究出了能形成菌落的固体培养基。1973年，我国上海农科院畜牧兽医研究所将猪肺炎支原体通过猪肺埋块细胞培养240余代的基础上，参考Goodwin等报导的复合培养基，使用了无细胞培养技术。1975年江苏农业科学院在Switer的培养基的基础上作了一些改进，创造了KM₂培养基。2000年版兽医生物制品制造及检验规程中提出以脑心浸粉和PPLO肉汤为主要原料的猪肺炎支原体培养基。2006年农业行业标准中提出猪支原体肺炎的病原分离用A26培养基。但现有技术的共同缺点是，猪肺炎支原体在培养基中的生长速度较慢，同时活菌滴度在10⁷～10⁸CCU左右，活菌滴度低，不够理想。

发明内容

本发明的目的在于提供一种营养成分丰富、渗透压适合猪肺炎支原体生长，且生长快、活菌滴度高的猪肺炎支原体培养基，按照该培养基培养的猪肺炎支原体生长速度快、活菌滴度高，分离的敏感性强，可用于猪肺炎支原体生化特征、遗传、免疫等方面的研究。

本发明另一目的是提供该猪肺炎支原体培养基的制备方法。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明的提供一种猪肺炎支原体培养基，该培养基主要由A液和B液和C液和/或琼脂组成；A液由脑心浸出液、PPLO肉汤、去离子水组成；B液由10×Hank’s液、乳清蛋白水解物、酵母浸出液、丙酮酸钠、示蛋白胨、硫代硫酸钠、0.1％酚红、青霉素、去离子水组成；C液为健康马血清。

其中，上述成分的配比如下：A液：脑心浸出液2.0～5.0g、PPLO肉汤1.5～5.0g、去离子水200～300ml；B液：10×Hank’s液1.0～5.0ml、乳清蛋白水解物1.0～3.0g、酵母浸出液3.0～5.0g、丙酮酸钠0.8～2.5g、示蛋白胨1.0～3.0g、硫代硫酸钠0.1～0.5g、0.1％酚红10～20ml、青霉素200～400u/ml、去离子水500～600ml；C液：健康马血清140～200ml；琼脂7.0～10g。

进一步，上述成分的配比如下：A液：脑心浸出液4.5g、PPLO肉汤4.0g、去离子水260ml；B液：10×Hank’s液3.0ml、乳清蛋白水解物1.25g、酵母浸出液4.5g、丙酮酸钠1.0g、示蛋白胨1.5g、硫代硫酸钠0.135g、0.1％酚红17ml、青霉素200u/ml、去离子水560ml；C液：健康马血清160ml；琼脂10g。

本发明还提供了该猪肺炎支原体培养基的制备方法，其特征在于制备步骤如下：

①按配比称取A液各成分，将各成分混合，搅拌，使之完全溶解，116℃高压灭菌20分钟，冷却后备用；

②按配比称取B液各成分，将各成分混合，搅拌，使之完全溶解，用0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存备用；

③按配比称取C液成分，将A液、B液和C液充分混合均匀，用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH至7.6～7.8，即得猪肺炎支原体的液体培养基。

进一步，该猪肺炎支原体培养基的制备方法中还可包括如下步骤：按配比称取琼脂，加入步骤③制得的培养基中，混合均匀，从而得到猪肺炎支原体的固体培养基。