[发明专利]一种表达猪瘟病毒E0、E2基因的重组腺病毒

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组腺病毒，尤其是一种能在同一腺病毒中表达猪瘟病毒E0基因和E2基因的重组腺病毒，属于生物技术领域。

背景技术

猪瘟是一种传染性非常强的传染病，常给养猪业造成毁灭性损失。目前，免疫接种仍是猪瘟防治的主要措施，而且是根除猪瘟病和阻止野毒传向无猪瘟病猪群的必要手段。猪瘟疫苗无论在过去、现在还是将来，对控制和消灭猪瘟病都具有极其重要的作用，各国学者对猪瘟疫苗的研制和开发一直没有放弃。传统的猪瘟疫苗有灭活疫苗和弱毒疫苗，其中灭活苗免疫效力低，保护期短，激发机体产生免疫力的速度慢，到目前为止，组织培养猪瘟毒的产量以及灭活疫苗所造成的病毒有效抗原的损失，仍是制造灭活疫苗的二大障碍；猪瘟弱毒疫苗的广泛应用，对于控制猪瘟的流行起到了关键作用，但是弱毒疫苗也存在下列不足：首先近年来猪瘟的流行特点发生了很大的变化，呈现周期性、波浪形的地区性散发和温和性猪瘟病，发病后的临床症状有无名高热、症状不典型、持续性感染、出生仔猪先天性震颤和母猪繁殖性障碍，用传统疫苗免疫常常造成免疫失败，即使将剂量增加到750个兔体反应(国家规定150个兔体反应)也不能预防其感染，而且有蔓延的趋势，在妊娠早期接种疫苗还会发生疫苗毒通过胎盘感染胎儿，造成死胎或弱仔并成持续性带毒者，产生新的疫源；其次，弱毒疫苗已经沿用了近40年，猪瘟的流行形式发生了很大变化，说明猪瘟病毒的抗原性可能存在着变异，特别是近年来国内外应用单克隆抗体对C-株检测，发现有不同的反应模式，表明经过多年在不同细胞上的驯化，C-株已经产生变异，这种流行毒株的变化趋势国内外情况基本一致，流行毒往往逃避免疫，导致免疫失败的严重后果；第三，接种弱毒疫苗还会影响到国际贸易，欧盟已禁止使用猪瘟弱毒疫苗，而采用严格的卫生防疫制度，扑杀猪瘟感染猪和血清学阳性猪来控制和消灭猪瘟，采用扑杀政策需要大量的人力、物力和巨额资金，发展中国家是难以承受的，这就促使人们研究和开发新型的猪瘟疫苗来防控本病。近年来，基因工程技术的迅猛发展，为新型猪瘟疫苗的研究和开发提供了工具，目前，猪瘟基因工程疫苗的研制已经成为新的研究方向和热点。

人-5型腺病毒载体与其他动物病毒载体相比，具有许多优点：首先是安全，腺病毒毒性低，基本不致病或只引起轻微的症状，腺病毒重组后，毒力进一步降低，并且克服了逆转录病毒载体因随机整合可能导致插入突变的潜在风险；其次是宿主范围广，腺病毒可感染多种细胞包括分裂与非分裂细胞；第三是稳定，腺病毒粒子十分牢固，不易突变，并且容易大量制备并纯化，得到高滴度的病毒，在体外可获得10¹¹pfu/mL；第四就是对于腺病毒基因组的结构和功能目前研究得比较清楚，基因操作方便；第五是插入外源基因容量大，在基因治疗构建重组疫苗中大多采用缺失E1和E3区基因的腺病毒载体，通常复制缺陷型腺病毒可容纳约7kb～8kb的外源基因，比逆转录病毒和腺相关病毒的容量大很多；还有就是免疫途径简便，腺病毒可以在消化道和呼吸道增殖，疫苗接种简便，可口服或气雾吸入而不需注射，并且经口服后能产生局部黏膜免疫应答，在免疫方法上比其它疫苗好，容易推广使用。

非复制型腺病毒不仅更安全有效，而且以低剂量的方式产生抗原蛋白而不裂解细胞，故表达抗原的时间更持久，有利于激发长期的免疫反应。目前，已经有多种产品已经上市，例如：“安柯瑞——重组人5型腺病毒注射液”；“重组人γ-干扰素腺病毒注射液(E10B)”；“今又生(重组人p53腺病毒注射液)”；“人禽流感重组腺病毒疫苗临床前安全评价方法的研究”取得阶段性成果；“重组腺病毒-胸苷激酶基因制剂”；另外“猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒和疫苗”已经被南京农业大学申请专利。

发明内容

为解决猪瘟弱毒疫苗长期接种导致的病毒返祖、毒力增强的现象和弱毒疫苗株与野毒发生重组等问题，以及猪瘟病毒E0、E2基因融合串联表达存在的产量低和保护效果弱的问题，本发明提供一种能在同一腺病毒中表达猪瘟病毒E0、E2基因的重组腺病毒。

本发明提供的是这样一种表达猪瘟病毒E0、E2基因的重组腺病毒，其特征在于在腺病毒的CMV启动子下游多克隆位点的Bgl II和KpnI酶切位点中插入猪瘟病毒E0基因，在Xho I和XbaI酶切位点中插入腺病毒CMV启动子和猪瘟病毒E2基因的CMV-E2片段。

所述猪瘟病毒为常规的市购病毒，猪瘟病毒的E0基因在GenBank中的登录号为：AF058715.1，猪瘟病毒的E2基因在GenBank中的登录号为：AY775178.2

所述腺病毒为常规的市购人-5型非复制型腺病毒。