[发明专利]用经修饰的微生物改善乙醇酸发酵产生

说明书

发明目的

本发明涉及用于从廉价的碳底物如葡萄糖或其它糖生物产生乙醇酸的改善的方法。本发明涉及修饰大肠杆菌K-12基因组DNA，使得所述微生物包含增加的乳清酸磷酸核糖基转移酶(orotate phosphoribosyl transferase，OPRTase)活性，其目的是减少副产物乳清酸的产生和优化乙醇酸合成。

发明背景

乙醇酸(HOCH₂COOH)(glycolic acid或glycolate)，是羧酸的α-羟基酸家族中最简单的成员。乙醇酸在非常小的分子上具有双官能性，即具有醇和中等强酸官能团。其性质使其非常适于广泛的消费和工业应用，包括用于水井再生(water well rehabilitation)，皮革工业，油气工业(oil and gas industry)，洗涤和纺织品工业，以及作为个人护理产品的成分。

乙醇酸亦可用于产生多种聚合材料，包括含聚乙醇酸的热塑性树脂。包含聚乙醇酸的树脂具有良好的阻气性质(gas barrier property)，且此类包含聚乙醇酸的热塑性树脂可用于制备具有相同性质的包装材料(例如饮料容器等)。聚酯聚合物在水性环境中以可控制的速率逐渐水解。该性质使其可用于生物医学应用如可溶解的缝线，以及用于其中需要酸的受控释放以减少pH的应用中。目前，在美国每年消费超过15,000吨的乙醇酸。

尽管乙醇酸作为痕量成分天然见于甘蔗、甜菜、葡萄和水果，但其主要是合成产生的。用于产生乙醇酸的其它技术描述于文献或专利申请中。例如，Mitsui Chemincals,Inc.描述了一种通过使用微生物从在末端具有羟基的脂族多元醇产生所述羟基羧酸的方法(EP2025759A1和EP2025760A1)。该方法是如Michihiko Kataoka在其关于使用乙二醇氧化微生物产生乙醇酸的论文中所述的生物转化(Biosci.Biotechnol.Biochem.,2001)。乙醇酸亦使用具有改善的腈水解酶活性的突变体腈水解酶从乙醇腈通过生物转化产生，且该技术由Dupont de Nemours and Co在WO2006/069110中公开。用于通过发酵从可再生资源使用其它细菌菌株产生乙醇酸的方法公开于来自Metabolic Explorer的专利申请(WO2007/141316和US61/162,712和EP09155971.6，其申请日为2009年3月24日)。

出于构建用于产生乙醇酸的更佳菌株的目的，本发明的发明人一直对一些特定大肠杆菌菌株感兴趣。

大肠杆菌为工业生物技术中使用的第一种生产微生物，且仍旧为最常用的一种。由于对大肠杆菌K-12菌株的多年研究，该菌株内的各种克隆对于操纵重组DNA和产生大量化学品是特别有吸引力的宿主。当前，用于研究和商业目的的大肠杆菌K-12菌株是在对该菌株的最早研究中构建和分离的克隆通过使用X射线辐照，之后用UV辐照以诱导随机突变所产生的衍生物(Bachmann,B.J.1987.Derivations and genotypes of some mutant derivatives of E.coli K-12,p.1191-1219.于J.L.Ingraham,K.B.Low,B.Magasanik,M.Schaechter和H.E.Humbarger(编),Escherichia coli and Salmonella typhimurium:cellular and molecular biology)。一些突变体或衍生物已经经有目的的选择而演化，并因此具有充分表征的突变。然而，亦认识到许多当前的衍生物含有未检测的和/或，尚未表征的等位基因差异。因此，大肠杆菌K-12菌株的成员彼此通过在一个或多个基因中的点突变而不同。

许多大肠杆菌K-12菌株在rph基因中具有移码突变(Jensen K.F.1993,J.Bacteriol.175:3401-3707)。该点突变导致在最后15个密码子的翻译中的移码，并使得rph基因产物的大小减少了10个氨基酸残基。该截短的蛋白缺乏核糖核酸酶PH活性，且在rph顺反子中的提前翻译终止解释了大肠杆菌K-12中乳清酸磷酸核糖基转移酶的低水平，因为需要转录和翻译的紧密偶联以支持越过顺反子间pryE减弱子的转录的最优水平。