[发明专利]用于减少病毒组合物中DNA杂质的方法

说明书

技术领域

本发明通常涉及疫苗的制造，特别是病毒的纯化，以及更特别是通过从用于病毒增殖的细胞基质中消除残余DNA而实现的病毒纯化。尤其是，本发明涉及使用传代细胞系的病毒生产，特别是使用Vero细胞。生产过程可包括收获目标病毒颗粒、净化病毒组合物、灭活病毒以及将病毒组合物与具有高离子强度溶液混合，随后通过体积排阻色谱的进一步纯化。本发明适用于医学产品（如用于人和动物的疫苗）制造的病毒生产，且特别是狂犬病病毒的生产。

背景技术

1介绍

改造的病毒颗粒可用于多种人类医学应用，比如疫苗。在这种情况下，需要对所用病毒组合物进行纯化，从而消除潜在的医学风险，比如由不需要的杂质而引起的副作用，或将副作用最大程度降低至可接受的水平。纯化过程包括去除包括源自用于培养病毒的细胞基质中不期望的残余DNA片段的各种杂质。然而，纯化过程必须生产出符合最严苛的监管安全标准的产品，所用的纯化方法不得降低病毒本身的医用性质，还不应使得生产过程是非经济有效的，以避免最终的医学产品变得价格过高。

依赖于使用核酸酶或化学试剂的纯化技术，将残余DNA降解为极小的片段，以至于不能引起明显临床风险，但这可能导致病毒颗粒的降解，继而不利地降低目标病毒的免疫原性。各种过滤、离心及其它净化病毒溶液的技术依赖于所需病毒相较于不期望的杂质之间差异的物理性质（比如尺寸重量、密度等），可能无法完全除去DNA以至于达到满足医学产品监管标准的水平。

纯化技术如离子色谱法等依赖于同病毒颗粒与不期望的杂质相关的电荷差异，这种方法可导致生产产量低，因而生产成本高。

本发明提供了一种成本有效的方式来标准化批量生产高纯病毒组合物，同时保留病毒颗粒的免疫原性。因此，本发明满足了生产高品质、高疗效且实惠的病毒组合物的需求，病毒组合物可满足安全和有效的国际监管标准，并因此适用于人类医学应用。

45年多以来，使用源自各种来源的原代细胞来增殖用于疫苗的病毒，来源包括：鸡胚胎以及猴、狗、兔和仓鼠肾脏细胞。虽然这些制造过程所生产的产品用于人类使用被认为是安全的，但是潜在的传染性病原体污染、个体动物之间的不一致性以及收集动物细胞的伦理敏感性导致对替代细胞基质的寻求。

发现二倍体细胞克服原代细胞中观察到的许多缺点。二倍体细胞的耐受性好、无致肿瘤性、染色体变异的频率低以及连续增殖的能力有限。然而，二倍体细胞难以用于批量生产而且成功的使用二倍体细胞对环境条件的要求更加严苛。

传代细胞系，第三类细胞基质，逐渐成为病毒生产的优选选择。传代细胞系的优势是无限生产标准且特征清晰的细胞，这些细胞生长快速并可用在生物反应器中大规模生产病毒。WHO建立了Vero细胞的主细胞库，Vero细胞是一种源自非洲绿猴肾脏的传代细胞系，被认为有助于疫苗抗原生产的细胞系（WHO技术报告747 1987）。

然而，传代细胞系本身和一些涉及其医学目的的用途的相关缺点。残余DNA可能会整合入宿主基因组中，可潜在地导致宿主/接受者DNA的恶性转化，导致细胞复制中的异常比如癌症。

有4个影响风险程度的因素：细胞基质本身，不同类型具有不同的安全性谱、DNA片段的尺寸，即200个碱基对以下通常小于功能基因的尺寸、施用途径，即通过口服DNA摄取的效率相对于肠胃外施用组合物的效率低约10000倍、以及存在的DNA浓度。

FDA联邦法规法典第21篇（title）第610.13部分对生物产品的普遍标准规定“产品应不含外源性材料，除非它是在已批准的生物许可应用中所描述的制造过程中所不能避免的”。WHO和国家监管机构也发布了具体的条例或指南，专门控制源自使用传代细胞系的生产过程的疫苗抗原中的DNA含量水平。

WHO专家委员会在1998年发表的关于生物学标准化技术报告878总结道“当这种DNA的量等于或少于100pg每肠胃外剂量时，在产品中和残余传代细胞系DNA相关的风险是可以忽略的”。委员会评估的结论为每疫苗纯化剂量中10ng以内的残余传代细胞系DNA视为是可接受的。

欧洲药品评价局专利药品委员会于2001年发表了关于使用人源致肿瘤性细胞生产生物和生物技术医学产品的立场声明，其引用了WHO的上述结论，但是还注明WHO报告所指出的当临床风险可能性较高时，例如，当残余DNA可含有感染性逆转录酶病毒前病毒体序列时，可发生意外。报告结论是成品中所允许的DNA水平“应尽可能低”，且以具体案例的风险因素评估为基础。