[发明专利]通过用自体血清培养自体角质形成细胞和成纤维细胞来生产用于生成皮肤的自体皮肤片或敷料的方法

权利要求书

1.一种利用皮肤产生片或敷料的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤

I-＊第0天：

A-获得自体皮肤和血液样品；

B-消化所述皮肤18小时；

C-从患者的血液中获得自体血清；

II-＊第1天：

D-将自体皮肤的两层分离；

E-将在消化之后获得的获自自体皮肤浅表层的角质形成细胞在自体血清中培养和复制72h；

F-培养和复制在消化之后所产生的获自深层的自体成纤维细胞；

III-＊第2天：

G-更换自体角质形成细胞的培养基；

IV-＊第3天：

H-将成纤维细胞接种在胶原网上；

I-将所培养的角质形成细胞在成纤维细胞和胶原网上接种24h；

V-＊第4天：

J-获得用于将其自身放置在对其有需要的个体上的最终产品例如皮肤片或敷料。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤I-A包括以下步骤：

1.从患者获得皮肤样品，其具有2mm²至4mm²、优选3mm²的面积和0.30mm至0.65mm的厚度，

2.从需要所述(自体的)皮肤的个体获得量为约20～50cm³的血液样品。

3.根据权利要求1或2之一所述的方法，其特征在于所述步骤I-B包括以下步骤：

3.用约2cm³至10cm³磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗所获得的皮肤样品；

4.在4℃下将所述自体皮肤样品在0.25％胰蛋白酶溶液中放置18小时。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于所述步骤I-C包括以下步骤：

5.将所述自体血液样品以1200rpm离心10分钟，获得10cm³至25cm³血浆；

6.在4℃下储存所述血浆；

7.通过添加2cm³至5cm³DMEM-HG(Dulbecco改良的Eagle培养基-高葡萄糖)、2cm³至5cm³磷酸盐缓冲溶液(PBS)和0.5cm³至2cm³ 10,000I.U.青霉素、10mg硫酸链霉素以及25/-1g两性霉素B使所应用的胰蛋白酶失活。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于所述步骤I-D包括以下步骤：

8.随后在镊子的帮助下将自体皮肤(外植体)分离成两层：浅表的表皮和包含胶原纤维的深层真皮；

9.用磷酸盐缓冲溶液(PBS)分别清洗所述外植物(两个皮肤层)多次(3至10次)。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于所述步骤I-E包括以下步骤：

10.将皮肤的浅表部分收集在无菌管中；

11.将所述管以1200rpm离心10分钟；

12.弃去上清液；

13.将所产生的细胞沉淀重悬于5cm³至10cm³ DMEM-HG培养基(Dulbecco改良的Eagle培养基-高葡萄糖)中；

14.将包含在该液体中的细胞以约75,000至90,000个细胞/cm²的密度接种在无菌盒中；

15.通过在Neubawer室中进行细胞计数来核实细胞密度；

16.将所接种的细胞(角质形成细胞)在37℃下储存24小时。