[发明专利]用于乳糜泻的乳酸菌

说明书

技术领域

本发明涉及用于治疗或预防乳糜泻(coeliac disease)的乳酸杆菌或链球菌。

背景技术

乳糜泻是一种小肠自身免疫性病症，发生于始自婴儿期所有年龄段的遗传易感人群。乳糜泻由对麦醇溶蛋白(gliadin)的反应引起，所述麦醇溶蛋白是存在于小麦(和小麦族(Triticeae，例如大麦以及黑麦)的相似蛋白)的谷蛋白中相关的富脯氨酸和谷氨酰胺蛋白家族。当暴露于麦醇溶蛋白时，组织转谷氨酰胺酶修饰蛋白质，且易患乳糜泻的受试者的免疫系统与小肠组织反应和交叉反应，导致炎症反应。之后，炎症引起绒毛萎缩且干扰包括矿物质和脂溶性维生素的营养素的吸收。乳糜泻的典型症状包括腹胀、呕吐、腹泻、体重减轻(或儿童发育障碍)、贫血以及疲乏。免疫系统对于麦醇溶蛋白的最强且最常见的反应是针对长度为33个氨基酸的α2-麦醇溶蛋白片段(本文中表示为SEQ ID NO:1)(Shan et al.2005 J.Proteome Res.4:1732-1741;Moron et al.2008;Am.J.Clin.Nut 87(2):405-14)。

经临床诊断的乳糜泻的发病率为0.05-0.27%。然而，来自欧洲、印度、南美、澳大利亚以及美国地区的人群研究显示儿童的发病率为0.33%-1.06%，成人的发病率为0.18-1.2%。数据表明许多人未被诊断出，仅具有轻度的胃肠不适症状。

至今为止，已知的唯一有效治疗是终生无谷蛋白饮食。

Siegel等(Siegel M.et al.,2006,Chem Biol 13(6):649-58)揭示了十二指肠中降解α2-麦醇溶蛋白的推定33-mer肽表位的酶组合(脯氨酰内肽酶和大麦谷氨酰胺特异性半胱氨酸内肽酶(EP-B2))。Piper等(Piper et al.,2004,J Pharm Exper.Therap 311:213-219)揭示了脯氨酰内肽酶降解麦醇溶蛋白肽的用途。WO 2007/108763揭示了用于促进乳糜泻或特应性皮炎的免疫耐受的植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株和鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株。WO 2006/097415揭示了一种由于细菌间的互补蛋白水解活性而能够降解麦醇溶蛋白肽的8种酸面团(sourdough)乳酸菌和双歧杆菌的混合物，所述麦醇溶蛋白肽例如A-麦醇溶蛋白的片段62-75和表位33-mer肽。从这些乳酸菌和双歧杆菌获得的焙烤食品可用于患有乳糜泻的受试者。WO03/028745揭示了具有能够降解外啡肽A5(衍生自谷蛋白的5-mer肽)的内肽酶的乳酸菌菌株。这些菌株能够降低肠病原性肽的浓度。

发明内容

进行体外研究以选择具有益生菌特性的乳酸菌菌株。选择了大量属于乳酸杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)或双歧杆菌属(Bifidobacterium)的菌株在培养上清中能够降解与乳糜泻有关的33-mer肽LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF(SEQ ID NO:1)的肽酶活性。

之后，对于最初所选的菌株，选择其在胃肠道存活的能力和上清肽酶活性在胃肠道中的稳定性，即其到达乳糜泻作用位点(即小肠)且在此仍具有活跃的降解33-mer肽的肽酶活性的能力。

接下来，检测所选的菌株降解推定与乳糜泻有关的其他肽的能力，所述肽即来自α-麦醇溶蛋白的20-mer肽QQLPQPQQPQQSPFQQQRPF(SEQ ID NO:2)和来自A-麦醇溶蛋白的13-mer肽LGQQQPFPPQQPY(SEQ ID NO:3)。

令人惊讶地，发现33-mer肽在模拟人消化道的条件下被缓慢降解，产生对人消化酶的进一步降解具有完全抗性的18-mer肽降解产物PQLPYPQPQLPYPQPQPF(SEQ ID NO:4)。该新发现使得能够通过选择乳酸菌菌株降解18-mer肽的能力而实现改进的进一步选择。

最终从大量菌株中选择了三种单菌株和两种菌株的混合物。这些菌株对于胃肠道条件具有抗性，产生在胃肠道条件下稳定的高肽酶活性，并且有利地降解与乳糜泻有关的33-mer、20-mer、13-mer肽且还降解具有抗性18-mer肽。从这些菌株纯化负责肽降解的酶，并将其表征、测序，在干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei)中，其被鉴定为与延长因子Tu相同的蛋白；在嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)中，其被鉴定为延长因子G。