[发明专利]排除错误信号的靶核酸序列的实时多路检测

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种排除错误信号（false signals）的靶核酸序列的检测。

【背景技术】

用于检测靶核酸的大部分技术包括靶核酸的扩增过程。核酸扩增是在分子生物学领域中所利用的必须的过程，并对此提出了多种扩增方法。例如，密勒（Miller）、H.I.等（WO89/06700）公开了包括将助催化剂/引物序列与靶单链DNA（ssDNA）杂交之后，转录上述序列的许多RNA复制过程的核酸序列扩增方法。

公知为聚合酶连锁反应（以下简称为“PCR”）的最为广泛利用的核酸扩增方法包括双链DNA的变性、向DNA模板进行寡核苷酸引物的退火以及DNA聚合酶引起的引物延长的反复的循环过程（Mullis等，美国专利第4，683，195号，第4，683，202号以及第4，800，159号；Saiki等，（1985）Science 230，1350-1354）。

基于聚合酶链式反应（PCR）的技术不仅利用在靶DNA序列的扩增，还广泛地利用在生物学和医学研究领域中的科学应用或方法中，例如，反转录酶-聚合酶链式反应（RT-PCR）、分别表示（Differential Display）-聚合酶链式反应（DD-PCR）、公知或未知的利用基因的PCR的克隆、cDNA末端的高速扩增（RACE）、任意的引发-聚合酶链式反应（AP-PCR）、多重PCR、单核苷酸多态性（SNP）基因组分型以及基于PCR的基因组分析等（McPherson and Moller，2000）PCR.BIOS Scientific Publishers，Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg，NY）。

另一方面，作为基于核酸扩增检测靶核酸的方法，正在开发出多种实时PCR方法。实时PCR方法能够实时检测靶的扩增产物，或者可实现更加正确的定量分析，在不存在污染问题的层面上备受瞩目。实时PCR方法，通常在扩增反应期间，使用可产生用于表示靶核酸序列存在的信号的、标记的寡核苷酸或DNA-结合染料（dye）。

作为代表性DNA-结合染料的荧光染料（SYBR Green）插入到双链DNA之间呈现荧光。但是，由于SYBR Green以非特异性插入到DNA链之间的可能性高，因而不适合做特异性靶检测。更严重的问题在于，当将SYBR Green技术应用于实时多重检测时，需要通过解链曲线分析（melting curve analysis）来鉴定扩增产物，因此被视为在时间及效率分析层面上不适合应用。

大部分的实时PCR方法使用标记寡核苷酸。以往的实时PCR方法在如下方面具有固有的特征：（i）标记寡核苷酸（引物或探针）的使用，（ii）标记寡核苷酸的特定形态或结构的形成（例如，发夹环结构）（iii）与寡核苷酸结合的标记的数量，（iv）信号的产生原理，或者（v）所利用的核酸聚合酶的性质。作为代表性的例子包括：拖慢探针（TaqManTM probe）方法（美国专利第5,210,015号）、分子信标（Molecular Beacon）方法（Tyagi等，Nature Biotechnology v.14MARCH 1996）、蝎形引物（Scorpion）方法（Whitcombe等，Nature Biotechnology 17:804-807（1999））、发卡式引物（Sunrise或Amplifluor）方法（Nazarenko等，2516-2521 Nucleic Acids Research,25（12）:2516-2521（1997）,及美国专利第6,117,635号）、力士（Lux）方法（美国专利第7,537,886号）、CPT（Duck P,等，Biotechniques,9:142-148（1990））、LNA方法（美国专利第6,977,295号）及叩诊槌（Plexor）方法（Sherrill CB,等，Journal of the American Chemical Society,126:4550-4556（2004））。

随着实时PCR方法的开发，公开一种能够同时检测多个靶核酸序列的实时多重PCR方法。实时多重PCR方法在如下的观点具有合理的优点：时间-有效性、比体积-有效性、方便性及高速-大量的动作性（R.N.Gunson,等,Journal of Clinical Virology,43:372-375（2008））。