[发明专利]母系诱导的动物不育

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2009年11月23日提交的美国临时申请号61/263,468的优先权，其公开的内容在此整体并入。

对在联邦政府资助的研究与发展下做出的发明权利的声明

本发明部分由美国科学和技术研究院先进技术项目(NIST-ATP)协议#70NANB3H3043和美国国家科学基金会SBIR基金#0912837的政府基金资助。

发明背景

存在对控制入侵物种和害虫例如鱼类、两栖动物、软体动物、甲壳类动物(crustaceans)和昆虫的技术的需要，该技术能替代用于大规模释放的辐射诱导的不育雄性。可靠的不育技术对基因工程的应用以使有益物种改进性状(例如，疾病抗性、改良生长或发育、杀虫剂抗性、破坏疾病传播机制)同样是有价值的。

传统上，商业水产养殖中已通过三倍体诱导(增加一套额外的染色体)来产生不育的鱼类。然而，通常认为三倍性能对许多物种的性能产生负面影响，并且最优方案是物种依赖性的。该技术的应用劳动量大，而且难以保证100％的鱼是三倍体并因此是不育的。

更简单的解决方案是用转基因或突变介导不育。已提议并测试了几种转基因方法来实现不育，但是时至今日，这些方法充其量是部分成功的。生理、细胞和分子水平上的不育尚未被证实(Thresheret al.(2009)Aquaculture 290：104-09以及Wong&van Eenennaam(2008)Aquaculture 275：1-12)。

主要障碍在于需要暂时逆转不育以繁殖品系。期望的是不需要在每一代都重复处理的解决方案。

以开发转基因不育鱼为目的的大部分研究集中于使参与性腺生长、分化和成熟的激素失活的方法。所推荐的激素靶标包括促性腺激素释放激素、卵泡刺激素和促黄体激素。这些关键基因的沉默原则上应能导致性不成熟和不育的鱼类，其生育力可通过外源递送缺失的激素来挽救。

虽然理论上是巧妙的，但是该方法中存在许多固有的困难。首要问题是在一些鱼类基因组中存在多种激素基因家族成员。此外，这些激素具有生育力以外的生物功能。最后，在依赖于敲低技术的模型中，不育并非100％，并且生育力的降低在性别和建群系之间不同。

沉默内源性生殖基因的备选方法是产生具有这样的基因的转基因系，该基因经设计能破坏早期胚胎发育模式形成中关键的信号转导通路，致使胚胎死亡。该方法利用基因敲低技术如反义RNA和dsRNA，或者利用成形基因的错误表达。将这些胚胎破坏物置于胚胎特异性启动子的控制下，所述胚胎特异性启动子在胚胎发育过程中表达。

为实现可逆性并允许品系繁殖，将构建体设计为使细菌阻抑系统置于启动子和关键发育基因破坏物之间。该系统利用商购的Tet-响应PhCMV*-11启动子。理论上，如果胚胎发育过程中短时间施加药物(如四环素或其衍生物)阻断破坏物基因的表达并提供对繁殖的可逆控制，则鱼类可圈养繁殖。至今，已证明致力于产生不育系不能成功。难以形成这些品系可能是由于Tet响应启动子易泄露，导致胚胎破坏物基因的低水平表达以及随后对建群系产生的选择。所述系统还需要使用细菌基因和启动子系统，这使商业化的管理审查过程变得复杂。该方法的其他缺点是需要使用四环素(或其衍生物)，这将增加生产成本并产生环境危害。

本发明克服了以前方法的许多缺点。本发明提供了能够使不同种类的脊椎动物和无脊椎动物有效绝育的转基因技术平台。另外，转基因系可易于繁殖而无需使用有潜在毒性或有害的物质。本技术可使有益物种的商业生产利润更高且在环境方面更有利。例如，养殖的水生物种的绝育将：1)防止基因流向野生种群以及养殖的非本地物种在新的生境建群(生物限制)；2)用改进的遗传学保护有价值的品系；3)通过减少性腺发育和性别分化消耗的能量或者通过允许产生全雄性种群而提高性能。如果物种的雄性比雌性生长更迅速，则全雄性种群是有利的。基本100％有效的绝育方法将使转基因技术的开发具有降低的风险，并且有显著改善目前限制技术的前景

因而，本发明提供明显的优势，包括：(i)100％的有效性；(ii)相对其他方法更低的成本(无需劳动力或处理以使品系繁殖或绝育)；(iii)所表达的基因产物不会负面影响宿主性能或不需要使用具有潜在的健康或环境风险的有毒基因或试剂；(vi)该策略在不同生物中应用广泛；(vii)利用同一构建体的靶物种范围广；以及(viii)转基因系易于繁殖。

发明简述