[发明专利]干细胞分化成为视网膜细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及在短期内使干细胞以高产量分化成为视网膜细胞的方法。更具体而言，本发明涉及通过在特别适合于分化步骤的不同培养基和时间内培养，使干细胞分化成为神经视网膜祖细胞、感光细胞前体细胞、感光细胞和其它视网膜细胞的方法。本发明还涉及按照所述方法产生的神经视网膜祖细胞、感光细胞前体细胞、感光细胞和其它视网膜细胞，包含所述细胞的用于治疗视网膜退化相关疾病的组合物，以及利用所述组合物治疗视网膜退化相关疾病的方法。

发明背景

失明是由于生理学或神经学原因而丧失视觉感知的医学病症。数以千万计的人(占世界人口的0.2-0.5%)受到失明的影响，并且在个人、社会和经济方面正遭受巨大的损失。视网膜光受体退化是先天或通过其它多种因素引起的失明的更占主导地位的病因之一，包括视网膜发育异常、视网膜退化、老年黄斑退化、糖尿病视网膜病变、视网膜色素变性、先天性视网膜失养症、Leber先天性黑朦、视网膜脱落、青光眼、视神经病变和外伤。迄今还没有开发出用于对这类疾病进行基础治疗的药物。到目前为止，用新的感光细胞替换这些视网膜疾病的α型和ω型异常感光细胞被认为是唯一有前景的疗法。感光细胞植入被认为通过延迟或抑制视网膜退化、再生退化的视网膜以及增强视网膜功能来预防失明或恢复有缺陷的视力。

干细胞已经成为用于视网膜疾病的细胞疗法的有用备选者，所述干细胞包括骨髓干细胞(BMSC)、脐带血干细胞、羊水干细胞、脂肪干细胞、视网膜干细胞(RSC)、胚胎干细胞(ESC)、诱导型多能干细胞(iPSC)和体细胞核移植细胞(SCNT)。

对于干细胞分化成为视网膜细胞(尤其是感光细胞)以及基于此的细胞疗法还没有得出有意义的研究结果。这些干细胞向视网膜细胞的分化可使以下几点成为可能：1)保证了用于有效细胞疗法的无限细胞来源，2)识别尚不清楚的由胚胎细胞和视网膜前体细胞成为视网膜细胞的分化机制，3)发现视网膜分化相关基因和分子及其损伤，4)理解视网膜退化性疾病的发病机理，以及5)开发用于预防视网膜退化和保护视网膜的药物。

自从其首次确立，人胚胎干细胞系就被认为具有分化成为用于多种疾病的细胞疗法的有用的各种类型细胞的能力。当人胚胎干细胞允许在临床治疗中精确检查发病机理并提供能够替代异常细胞的新鲜细胞时，其似乎具有高潜能。在完全确定的可再生条件下产生人ESC来源的视网膜感光细胞及其在移植法中的用途保证了其是用于视网膜感光细胞相关疾病的极其有力且有效的疗法。假设人ESC来源的细胞与通过正常分化过程所形成的细胞具有相同的性质和功能。基于这种假设，以与产生以下细胞的发育阶段相似的条件下诱导分化：表达胰激素的内分泌细胞(D'Amour,et al.,Nat.Biotechnol.,2006；24:1392-401)、神经元(Pankratz,et al.,Stem Cells 2007；25:1511-20)、肌细胞(Barberi et al.,Nat.Med.,2007；13:642-8)和血管内皮细胞(Wang,et al.,Nat.Biotechnol.,2007；25:317-8)。并且，已经进行多次尝试来将人ESC分化成为可有效用于治疗视网膜疾病的感光细胞，但是大多数情况都以失败告终。

实际上，从人胚胎干细胞分化成为视网膜祖细胞是在该领域内迄今为止所作出的最大成就，但是从视网膜祖细胞分化成为感光细胞却失败了(分化率低于0.01%)(Lamba,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2006；103:12769-74)。一项报道称，人胚胎干细胞被成功诱导分化成为感光细胞，但是其中所用的方法对于分化总共需要超过200天，而其中的分化率低至8%，因此不可能用于临床治疗失明(Osakada et al.,Nat.Biotechnol.,2008；26:215-24)。

发明概述

技术问题

由本发明人对人ESC分化成为感光细胞进行了广泛且深入的研究而产生了本发明，产生以下发现：在既不用基因植入也不用与视网膜组织共培养的条件下，化学限定的用于分化成为感光细胞的体外条件允许人干细胞在四周内以高产量分化成为感光细胞，所述体外条件与体内条件相似。并且最终分化的细胞群体比起始人胚胎干细胞更高260倍，因而可应用于临床移植。

解决问题的方案

因此，本发明的目的是在无需基因植入和与视网膜组织共培养的条件下，通过在化学限定的条件下实施与体内胚胎发育相似的分化过程，提供诱导干细胞在较短的时间内以高产量分化成为视网膜细胞(包括大量的感光细胞及其祖细胞)的方法。